基于自組裝多肽的免疫分析技術在體外檢測中的初步應用研究.pdf

1、有些小分子多肽在水介質中可自發(fā)或觸發(fā)形成超分子結構材料，組裝形成形態(tài)結構和功能特異的自組裝體。通過設計不同的氨基酸序列可得到多種具有特殊功能的多肽納米材料。酶催化的小分子多肽自組裝因其在超分子結構上容易進行調整和控制，而且具有生物選擇性良好、在體內易降解、產物無毒等優(yōu)點，近些年來，在生物傳感器、材料科學、生物醫(yī)藥及臨床醫(yī)學等領域都有廣闊的應用前景。
　　自組裝多肽形成的獨特三維網絡結構是發(fā)揮其特異功能的基礎，有的結構可以改變一些熒

2、光分子的光學性質，因此表現(xiàn)出在水溶液中完全不同的光學行為。本研究應用了三種酶響應的小分子多肽Nap-GFFY-NMe、Ada-GFFY-OMe和Nap-FFK(NBD)Y，這三種酶的共同特點是都在堿性磷酸酶的誘導下形成二級結構，自組裝成超分子水凝膠。其中Nap-GFFY-NMe和Nap-FFK(NBD)Y在堿性磷酸酶誘導下形成以β-折疊二級結構為基礎的納米纖維結構，肉眼可見果凍樣的水凝膠，而Ada-GFFY-OMe形成納米纖維球，肉眼可

3、見渾濁現(xiàn)象。剛果紅和硫磺素T是檢測β-淀粉樣蛋白聚集體的熒光探針分子，當結合富含β-折疊的結構時，熒光強度會增強。堿性磷酸酶誘導β-折疊形成，與β-折疊結合可以增強剛果紅和硫磺素T熒光強度，形成信號的級聯(lián)放大。因此我們將三種小分子多肽引入到以堿性磷酸酶為標記酶的ELISA檢測體系，通過獨特的信號放大原理以提高傳統(tǒng)ELISA的檢測靈敏度。
　　實驗一我們建立了基于小分子短肽Nap-GFFY-NMe與剛果紅的信號讀出模式，實現(xiàn)了血小板

4、活化標志物P-選擇素的定量檢測，與傳統(tǒng)ELISA相比靈敏度提高了十倍。同時，由于P-選擇素檢測有利于評價血小板活化狀態(tài)，對服用抗凝藥物的血栓患者，實施P-選擇素的動態(tài)監(jiān)測將有助于評估治療效果，在不同時間段采集的標本同時檢測可以顯著降低系統(tǒng)誤差，增加結果的準確性，我們評價了NMe-剛果紅讀出模式與ELISA分批次檢測的誤差，發(fā)現(xiàn)NMe-剛果紅讀出模式的變異系數(shù)顯著低于傳統(tǒng)ELISA，由于剛果紅形成的熒光信號較穩(wěn)定，使多個不同時間段分析的酶

5、標板同時進行信號讀出成為可能。
　　實驗二我們應用短肽Nap-FFK(NBD)Y與硫磺素T建立了一種紫外吸收和熒光雙信號讀出的肺炎支原體IgM型抗體檢測方法。肺炎支原體IgM抗體是在肺炎支原體感染早期出現(xiàn)的抗體，是輔助診斷急性感染的重要標志物。利用該方法檢測肺炎支原體感染者血清中的IgM抗體，顯示較好的靈敏度，與臨床實驗室用的常規(guī)檢測方法比較，相關性較好。該方法采用了一種新的ELISA信號讀出模式，實現(xiàn)了紫外吸收和熒光雙信號檢測，

6、為檢驗工作者提供了更多選擇。
　　實驗三我們建立了基于自組裝多肽的可視化檢測方法。鑒于堿性磷酸酶誘導Ada-GFFY-OMe形成肉眼可見的渾濁現(xiàn)象，在傳統(tǒng)ELISA基礎上，我們直接加入OMe溶液，通過肉眼觀察渾濁程度判斷檢測結果。同時在ELISA酶標板、圓柱形的毛細管中進行了嘗試。另外在基于NMe和剛果紅的檢測系統(tǒng)中，剛果紅顏色的變化也可以用于肉眼讀出。
　　綜上，我們引入小分子多肽，在傳統(tǒng)ELISA基礎上建立了全新的信號讀