兩個(gè)家蠶FKBP12基因的研究.pdf

1、FKBPs是免疫抑制劑FK506的胞內(nèi)受體蛋白,這些蛋白參與多種生理學(xué)作用,包括蛋白折疊,T細(xì)胞激活的抑制調(diào)節(jié),以及細(xì)胞周期抑制等。12 kD的FKBPs蛋白是其代表性成員,在各物種細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)且高度保守,具有PPIase活性。目前只是發(fā)現(xiàn)在脊椎動(dòng)物中有多個(gè)FKBP12亞型,而我們通過(guò)NCBI家蠶基因庫(kù)中找到兩條完整編碼家蠶FKBP12蛋白的mRNA序列,命名為Bm-FKBPl2A和Bm-FKBP12B,基因登錄號(hào)分別為DQ44319

2、7和DQ443423。多物種序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),FKBP12同源基因以及同源異性基因在氨基酸水平上具有高度的相似性,Bm-FKBP12A蛋白與人的FKBP12蛋白同源性為77％,Bm-FKBP12B蛋白與人的FKBP12蛋白同源性為73％,Bm-FKBP12A和Bm-FKBP12B之間的相似性為83％。Bm-FKBP12A蛋白推測(cè)的的分子量、等電點(diǎn)分別為11.82kD和7.86,Bm-FKBP12B蛋白的分子量、等電點(diǎn)分別為11.63kD和8

3、.79,這些特征與已知的FKBP12蛋白相似。
　　 將兩種FKBP12基因的cDNA序列與家蠶全基因組序列進(jìn)行比對(duì),兩個(gè)基因都由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成,但Bm-FKBP12A基因的內(nèi)含子序列要比Bm-FKBP12B長(zhǎng)。通過(guò)在線網(wǎng)站分析了Bm-FKBP12A和Bm-FKBP12B的啟動(dòng)子序列并對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行了染色體定位預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因都定位在20號(hào)染色體上,距離相差1500kbp。Bm-FKBP12A在5'端上游(-361

4、)-(-311)bp的區(qū)域有一個(gè)啟動(dòng)子序列,Bm-FKBP12B在5'端上游(-161)-(-121)bp的區(qū)域有一個(gè)啟動(dòng)子序列。組織特異性順式作用元件沒(méi)有在Bm-FKBP12A和Bm-FKBP12B基因中發(fā)現(xiàn),說(shuō)明家蠶FKBP12蛋白在各組織中廣泛表達(dá)。
　　 Bm-FKBP12B基因的ORF被克隆到pGEX-4T-3載體中,在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合蛋白GST-Bm-FKBP12B,通過(guò)GST親和層析,得到較純的融合蛋白G

5、ST-Bm-FKBP12B,凝血酶將融合蛋白中的GST切除后,再通過(guò)分子篩SephadexG-75進(jìn)一步純化。將經(jīng)過(guò)純化的Bm-FKBP12B作為抗原免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,ELISA檢測(cè)該抗血清的效價(jià)達(dá)到1:12800以上。對(duì)純化的Bm-FKBP12B蛋白進(jìn)行了PPIase活性測(cè)定,結(jié)果顯示具有較高活性。通過(guò)相似EST搜索、實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR和Western blotting分析了兩種FKBP12蛋白在家蠶各個(gè)時(shí)期的表達(dá)以

6、及各個(gè)組織的分布。發(fā)現(xiàn)Bm-FKBP12存在于家蠶各個(gè)組織及各個(gè)時(shí)期,Bm-FKBP12A的轉(zhuǎn)錄本在各個(gè)組織均比Bm-FKBP12B高,而B(niǎo)m-FKBP12B的轉(zhuǎn)錄本在蛾期和胚胎期最高。Western blotting顯示FKBP12在絲腺和腸的表達(dá)最高,暗示在吐絲前期FKBP12蛋白可能對(duì)絲腺的基因表調(diào)控以及絲蛋白的形成具有重要作用。GST-Pull down顯示家蠶FKBP12與Hmol蛋白不能發(fā)生體外互作。以上這些結(jié)果為深入研究家