腦缺血預處理誘導腦缺血耐受過程中NF-κBP50、NF-κBP65以及PPARγ蛋白的表達變化.pdf

1、目的:以往大量的實驗證明，預先給予輕微的、短時的、不至于對錐體神經元造成損傷的腦缺血預處理(cerebral ischemic preconditioning，CIP)，可以減少缺血-再灌注損傷，產生腦缺血耐受(brain ischemictolerance，BIT)。腦缺血預處理對機體的保護作用實際上是通過啟動機體內源性保護機制實現(xiàn)的。此理論自從1990年被日本著名科學家Kitagawa提出后，全世界許多科學家進行了大量的動物實驗，證

2、明了此觀點的正確性。核轉錄因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種細胞核轉錄因子，NF-κB信號通路屬于受調蛋白水解酶依賴的受體信號傳導通路，其與腫瘤的發(fā)生、生長、分化、凋亡、感染以及轉移密切相關;此外，NF-κ B在靜息狀態(tài)下與IκB在細胞的胞漿中形成復合體，當某些因素刺激細胞時，可使IκB發(fā)生磷酸化并與NF-κB發(fā)生解離，從而使NF-κB激活，被激活的NF-κB參與到基因轉錄過程中。NF-κB有許

3、多亞型，而P50和P65就是其中最重要的兩個，它們在協(xié)調免疫功能以及抗感染方面有著重要的作用。但在腦缺血預處理誘導腦缺血耐過程中不同時間段如何變化目前尚不清楚。
　　過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome prolifer atoractivatedreceptors，PPAR)是一類可被配體激活的核轉錄因子超家族成員，其對細胞的生長、分化、凋亡等具有重要調節(jié)作用。PPAR包括3種亞型，即PPARα、PPARβ、PPARγ

4、。其中PPARγ被激活后可以產生多種生物學效應，可以很好的保護腦組織對抗機體的缺血性打擊，而且在許多臨床疾病中如:肝硬化、動脈粥樣硬化、高血壓以及高血脂等具有很好的緩解效果。基于以上分析，本實驗旨在觀察腦缺血預處理誘導腦缺血耐受過程中在海馬CA1區(qū)NF-κB P50和P65以及PPARγ蛋白表達的變化，從而為臨床上腦缺血疾病的預防和治療提供相應的理論依據(jù)。
　　方法:采用四血管閉塞全腦缺血模型，選用健康雄性Wistar大鼠(280

5、-300g)102只，隨機分為以下六組:
　　(1) control組(n=3):不進行任何處理。
　　(2) sham組(n=3):暴露雙側椎動脈，暴露雙側頸總動脈，但均不阻斷其血流。
　　(3)凝閉椎動脈（vertebral artery occlusion，VAO）組(n=24):永久性凝閉雙側椎動脈，48 h后暴露雙側頸總動脈，不阻斷血流。
　　(4) CIP組(n=24):永久性凝閉椎動脈，48 h后夾

6、閉雙側頸總動脈3min后恢復血流再灌注。
　　(5)損傷性缺血(ischemic insult，Ⅱ)組(n=24):永久性凝閉椎動脈，48 h后夾閉雙側頸總動脈8 min后恢復血流再灌注。
　　(6) CIP+Ⅱ組(n=24):永久性凝閉椎動脈，48 h后先夾閉雙側頸總動脈3 min，然后恢復血流再灌注48 h后，再夾閉雙側頸總動脈8 min后恢復血流再灌注。
　　除control組和sham組之外，其余4組都選取8個

7、時間點，分別是假手術處理后或末次缺血后的0 min、15 min、30 min、1h、3h、6h、2d、7d(每個時間點n=3)。
　　在規(guī)定的時間點，斷頭取大鼠的腦組織，通過應用硫堇染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經元的存活情況;通過免疫組織化學技術(immunohistochemistry)觀察NF-κB P50、P65、PPARγ蛋白在大鼠海馬CA1區(qū)的表達程度以及變化趨勢。
　　結果:
　　1神經病理學評價

8、>　　通過對大鼠腦片進行硫堇染色可以觀察到，control組大鼠海馬CA1區(qū)神經元排列致密有序、整齊、2-3層，細胞形態(tài)完整，胞核清晰可見，核仁飽滿。與control組對比，Sham組大鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)無顯著變化，ND無顯著差異(P＞0.05)。VAO組與sham組對比，各個時間點細胞形態(tài)無顯著變化，ND無顯著差異(P＞0.05)。
　　CIP組各時間點CA1區(qū)的神經元均未見顯著損傷，與VAO組各相應時間點相比，細胞形態(tài)無

9、顯著變化，ND無顯著差異(P＞0.05)。
　　Ⅱ組6h之內CA1區(qū)的神經元未見顯著損傷;2d時可見部分細胞萎縮、變性、壞死，核仁萎縮，細胞排列開始變得不規(guī)則;7d時可見大量細胞變性壞死，正常的神經元幾乎不可見。與VAO組相比，2d和7d時間點細胞形態(tài)有顯著變化，ND顯著降低(P＜0.05)。
　　CIP+Ⅱ組即刻時間點、6h時間點、2d時間點CA1區(qū)神經元均無顯著受損;在7d時間點有個別細胞丟失壞死，細胞排列較為規(guī)則。與Ⅱ

10、組對比，7d時間點細胞數(shù)量顯著增多，核仁清晰，細胞排列規(guī)則，具有顯著差異（P＜0.05）
　　2在腦缺血預處理誘導腦缺血耐受過程中，大鼠海馬CA1區(qū)NF-κBP50蛋白表達的對比以及變化趨勢
　　Control組、sham組以及VAO組，可見NF-κB P50蛋白在胞核內幾乎不表達，但胞漿內有一定數(shù)量的表達。Sham組與control組相對比，蛋白表達量無顯著差異(P＞0.05);VAO組與Sham組相對比，各個時間點蛋白表

11、達量亦無顯著變化(P＞0.05)。
　　CIP組即刻時間點NF-κB P50蛋白在胞核內幾乎不表達，但在胞漿內有一定表達量。從30 min起，NF-κB P50蛋白逐漸在胞核內開始有所表達，積分光密度也顯著增加(P＜0.05);從1h開始，胞核內NF-κB P50的表達更加顯著，到了6h時，蛋白表達在胞核內達到頂峰(P＜0.05)。2d時，胞核內NF-κB P50蛋白表達量顯著減少，積分光密度也顯著下降，幾乎達到了VAO組相應時間

12、點的水平(P＞0.05)。此水平一直持續(xù)至7d時間點。
　?、蚪M即刻時間點NF-κB P50在胞核內幾乎不表達，但在胞漿內有一定表達量。從30 min開始，胞核內蛋白表達量有了顯著升高，與VAO組相比，30 min、1h、3h、6h時間點胞核內的蛋白表達量有了顯著升高，積分光密度也隨之升高，并在6h時間點達到頂峰(P＜0.05)，此時胞漿內與胞核內均可見大量蛋白表達。2d時間點NF-κB P50蛋白含量顯著下降，降低至VAO組相應

13、時間點水平(P＞0.05)。7d時間點由于神經元大量死亡，NF-κB P50蛋白含量顯著下降，與VAO組相對比有顯著降低(P＜0.05)。
　　CIP+Ⅱ組即刻時間點NF-κB P50在胞核內幾乎不表達，但在胞漿內有一定的表達量。從30 min開始，胞核內開始逐漸出現(xiàn)蛋白表達，積分光密度也開始有所上升，但與即刻時間點相比差異仍不明顯(P＞0.05);與即刻時間點相比，1h、3h、6h時間點胞核內蛋白含量有了顯著上升(P＜0.05)

14、。2d時間點胞核內表達量顯著降低，積分光密度也開始降低，幾乎達到了VAO組相應時間點的水平。
　　對比各組6h時間點NF-κB P50蛋白的表達數(shù)量，與VAO組對比，CIP組、Ⅱ組此時間點NF-κB P50蛋白含量均顯著升高(P＜0.05);與CIP組相比，Ⅱ組NF-κB P50蛋白含量進一步增高(P＜0.05);與Ⅱ組相比，CIP+Ⅱ組蛋白含量顯著下降(P＜0.05)。
　　對比各組7d時間點NF-κ B P50的表達數(shù)量

15、，與VAO組相對比，CIP組NF-κB P50蛋白含量無顯著差異(P＞0.05)，Ⅱ組顯著下降（P＜0.05）;與Ⅱ組相比，CIP+Ⅱ組NF-κB P50蛋白含量顯著上升(P＜0.05)。
　　3在腦缺血預處理誘導腦缺血耐受過程中，大鼠海馬CA1區(qū)NF-κBP65蛋白表達的對比以及變化趨勢
　　Control組、sham組以及OVA組NF-κB P65蛋白在胞核和胞漿中均有一定程度的表達。
　　CIP組NF-κB P6

16、5蛋白表達在30 min時間點之前未見顯著變化(P＞0.05);從1h時間點起積分光密度顯著增加，3h、6h時間點進一步增高，胞核和胞漿內均有大量蛋白表達，并于6h時間點達到頂峰（P＜0.05）;此后的變化趨勢與NF-κB P50的一致。
　?、蚪MNF-κB P65蛋白表達在15 min時間點之前未見顯著變化;從30min時間點起積分光密度顯著增加，1h、3h、6h時間點進一步增高，胞核和胞漿內均有大量蛋白表達，并于6h時間點達到

17、頂峰;2d時間點，NF-κB P65蛋白表達顯著減少，尤其以胞核中減少為主，但表達量仍高于VAO組相應時間點(P＜0.05);此后的變化趨勢與NF-κκB P50的一致。
　　CIP+Ⅱ組NF-κB P65蛋白表達在15 min時間點之前未見顯著變化;從30 min時間點起積分光密度顯著增加，1h、3h、6h時間點進一步增高，胞核和胞漿內均有大量蛋白表達，并于6h時間點達到頂峰。此后的變化趨勢與NF-κB P50的一致。
　

18、　對比各組6h時間點NF-κB P65蛋白的表達數(shù)量，與VAO組對比，CIP6 h、Ⅱ6h時間點蛋白含量有顯著上升(P＜0.05)。與Ⅱ6h時間點相比，CIP+Ⅱ6 h時間點蛋白含量有顯著下降(P＜0.05)。
　　對比各組7d時間點NF-κB P65蛋白的表達數(shù)量，與VAO組對比，CIP7 d時間點蛋白含量無明顯差異(P＞0.05)，Ⅱ7d時間點顯著下降(P＜0.05)。與Ⅱ6h時間點相比，CIP+Ⅱ6 h時間點蛋白含量有顯著上

19、升(P＜0.05)。
　　4在腦缺血預處理誘導腦缺血耐受過程中，大鼠海馬CA1區(qū)PPARγ蛋白表達的對比以及變化趨勢
　　Control組、sham組以及VAO組可見PPARγ蛋白在胞核和胞漿內均有一定程度的表達。
　　CIP組PPARγ蛋白表達在15 min時間點之前未見顯著變化(P＞0.05);從30 min時間點起積分光密度顯著增加，1h、3h時間點進一步增高，胞核和胞漿內均有大量蛋白表達，并于3h時間點達到頂峰

20、(P＜0.05)。在6h、2d、7d時間點時，胞核內PPARγ蛋白表達量顯著下降，幾乎達到了VAO組相應時間點的水平。
　?、蚪MPPARγ蛋白表達在15 min時間點之前未見顯著變化(P＞0.05);從30min時間點起積分光密度顯著增加，1h、3h、6h時間點進一步增高，胞核和胞漿內均有大量蛋白表達，并于6h時間點達到頂峰(P＜0.05)。2d、7d時間點由于神經元大量死亡，所以PPARγ蛋白含量顯著下降，與VAO組相對比有顯著

21、下降（P＜0.05）。
　　CIP+Ⅱ組PPARγ蛋白表達在1h時間點之前未見顯著變化(P＞0.05);從3h時間點起PPARγ蛋白表達顯著增加，6h時間點進一步增高，胞核和胞漿內均有大量蛋白表達，并達到峰值(P＜0.05)。此后的變化趨勢與P50的一致。
　　對比各組6h時間點PPARγ蛋白的表達數(shù)量，與VAO組對比，CIP組此時間點PPARγ蛋白含量無顯著差異(P＞0.05)，Ⅱ組此時間點PPARγ蛋白含量有顯著增高(P

22、＜0.05);與CIP組相比，Ⅱ組PPARγ蛋白含量顯著增高(P＜0.05);與Ⅱ組相比，CIP+Ⅱ組蛋白含量顯著下降(P＜0.05)。
　　對比各組7d時間點PPARγ蛋白的表達數(shù)量，與VAO組相對比，CIP組PPARγ蛋白含量無顯著差異(P＞0.05)，Ⅱ組顯著下降(P＜0.05);與Ⅱ組相比，CIP+Ⅱ組PPARγ蛋白含量顯著上升(P＜0.05)。
　　結論:
　　1腦缺血預處理適度上調NF-κB P50、NF-