硫化氫對Takotsubo心肌病的保護(hù)作用及其機(jī)制探討.pdf

1、Takotsubo心肌病(Takotsubo cardiomyopathy,TCM)發(fā)病急驟，臨床癥狀與急性冠脈綜合征相似，臨床中診斷為急性冠脈綜合征的患者中約有2％的患者為Takotsubo心肌病。Takotsubo心肌病急性死亡率大約1％-4.2％。由于此病急性發(fā)病時(shí)左心室收縮末期心尖部、心中部運(yùn)動(dòng)不能，運(yùn)動(dòng)不足或運(yùn)動(dòng)障礙，心臟基底部收縮過度，病變時(shí)心臟形態(tài)類似于捕章魚的魚簍，所以命名為Takotsubo心肌病。Takotsubo心

2、肌病多見于中老年女性患者,大部分患者發(fā)病前均有嚴(yán)重的精神或軀體應(yīng)激性誘因，臨床中患者以胸痛或心前區(qū)壓榨性疼痛為首發(fā)癥狀，也可表現(xiàn)為心悸、暈厥、惡心、嘔吐、呼吸困難，發(fā)病急性期可出現(xiàn)心源性休克、心臟驟停、室間隔缺損、急性肺水腫、呼吸衰竭、嚴(yán)重的室性心律失常以及心臟破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥。但Takotsubo心肌病室壁運(yùn)動(dòng)異常區(qū)域超過單支冠狀動(dòng)脈支配范圍，且不伴有冠狀動(dòng)脈閉塞。由于對Takotsubo心肌病的逐漸認(rèn)識和關(guān)注，臨床中發(fā)現(xiàn)的Takot

3、subo心肌病病例的數(shù)量持續(xù)增加，但對其發(fā)病機(jī)制、病理變化、規(guī)范治療仍然缺乏充分的依據(jù)。故進(jìn)一步研究該疾病有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。
　　硫化氫（hydrogen sulfide,H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后，被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在。硫化氫在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的保護(hù)作用。各種心肌缺血模型和過度刺激β腎上腺素受體能夠使大鼠體內(nèi) H2S含量明顯下降，給予外源性硫化氫或者促進(jìn)內(nèi)源性硫化氫產(chǎn)生

4、，均可明顯減小缺血再灌注心肌的損傷面積和心梗死面積，從而對心肌發(fā)揮保護(hù)作用。H2S可以通過開放心肌細(xì)胞KATP通道，減輕氧化應(yīng)激損傷、促進(jìn)體內(nèi)NO合成，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性，抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、保護(hù)線粒體等多種機(jī)制發(fā)揮心血管的保護(hù)作用。目前，關(guān)于硫化氫對Takotsubo心肌病的保護(hù)作用機(jī)制仍不明確，本文利用Takotsubo心肌病動(dòng)物模型和H9c2心肌細(xì)胞探討Takotsubo心肌病發(fā)病機(jī)制，探討硫化氫對Takots

5、ubo心肌病的影響及其作用機(jī)制。本研究共分三部分。
　　第一部分：外源性硫化氫對Takotsubo心肌病心功能的影響
　　目的：
　　探討外源性給予硫化氫是否可以調(diào)節(jié)和保護(hù)Takotsubo心肌病動(dòng)物模型的心功能
　　方法：
　　1.本實(shí)驗(yàn)選用健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，大鼠腹腔注射異丙腎上腺素(isoprenaline,ISO)50mg/kg制備Takotsubo心肌病大鼠模型.

6、r>　　2.應(yīng)用powerlab及換能器監(jiān)測Takotsubo心肌病大鼠左心功能指標(biāo)，并給予不同濃度的NaHS（10,50,100, or200μmol/kg，i.p.）預(yù)處理，篩選出對Takotsubo心肌病具有最佳保護(hù)作用的NaHS濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.心臟超聲觀察Takotsubo心肌病大鼠的心功能及NaHS對Takotsubo心肌病的心功能影響。
　　4.檢測Takotsubo心肌病大鼠的心肌酶及NaHS對T

7、akotsubo心肌病的心肌酶影響。
　　5.H&E染色檢測心肌組織形態(tài)學(xué)變化
　　6.檢測Takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織硫化氫濃度及內(nèi)源性產(chǎn)生硫化氫的酶，觀察NaHS對Takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織硫化氫濃度及內(nèi)源性產(chǎn)生硫化氫的酶的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Takotsubo心肌病大鼠的左心室功能指標(biāo)LVSP及±dp/dtmax與對照組相比顯著下降，LVEDP與對照組相比顯著升高。

8、r>　　2.Takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中硫化氫水平明顯降低，心肌組織中CSE、3-MST表達(dá)明顯降低，但對心肌組織CBS表達(dá)無明顯影響。NaHS可以增加Takotsubo心肌病大鼠血清及心肌組織中硫化氫水平，增加心肌組織中CSE、3-MST蛋白表達(dá)。
　　3.不同劑量的NaHS（10,50,100,200μmol/kg）能夠增加Takotsubo心肌病大鼠LVSP及+dp/dtmax，降低LVEDP。NaHS100

9、μmol/kg具有最明顯的保護(hù)效應(yīng)。
　　4.心臟超聲結(jié)果顯示，Takotsubo心肌病大鼠LVEF、LVFS明顯降低，心室壁運(yùn)動(dòng)不規(guī)律，心尖部、心中部室壁收縮功能降低，心底部收縮正常，左心室病變時(shí)形狀類似于“章魚簍”或“氣球樣”改變。NaHS預(yù)處理可以升高Takotsubo心肌病大鼠LVEF、LVFS，減輕Takotsubo心肌病大鼠不規(guī)律室壁運(yùn)動(dòng)。
　　5.Takotsubo心肌病大鼠血漿中CK、CK-MB、LDH、AS

10、T水平均明顯升高。NaHS可以降低Takotsubo心肌病大鼠CK，CK-MB，LDH和AST活性。
　　6.Takotsubo心肌病大鼠心肌H＆E染色顯示心肌纖維完整，排列整齊，染色較均勻，結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞核、細(xì)胞裝完整，未見細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠給予異丙腎上腺素可以很好的模擬臨床中Takotsubo心肌病，左心功能指標(biāo)、心臟超聲檢查均提示心功能損傷，心肌酶CK、CK-MB、LDH、AST

11、水平明顯升高。
　　2.NaHS預(yù)處理可以改善Takotsubo心肌病模型大鼠左心功能指標(biāo)，提高LVEF、LVFS，減輕室壁運(yùn)動(dòng)的不規(guī)律。
　　3.Takotsubo心肌病大鼠血清及心肌組織中硫化氫水平降低，心肌組織CSE、3-MST蛋白表達(dá)降低。說明硫化氫在Takotsubo心肌病發(fā)病過程及病理損害過程中發(fā)揮作用。NaHS預(yù)處理可以增加Takotsubo心肌病大鼠血清及心肌組織中硫化氫水平，使心肌組織 CSE、3-MST蛋

12、白表達(dá)增加。
　　第二部分：外源性硫化氫通過抑制NADPH氧化酶減輕Takotsubo心肌病大鼠心肌氧化應(yīng)激損傷
　　目的：
　　觀察和探討硫化氫保護(hù)Takotsubo心肌病心功能的機(jī)制
　　方法：
　　1.心肌組織DHE染色觀察心肌組織超氧陰離子水平。
　　2.應(yīng)用H2O2、MDA、SOD、GSH試劑盒檢測血漿和心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化。
　　3.Western blot檢測心肌組織中NO

13、X2、NOX4、p67蛋白的表達(dá)。
　　4.TUNEL染色觀察心肌組織凋亡的變化。
　　5.Western blot檢測心肌組織中促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-xL蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.左心室冰凍切片DHE染色結(jié)果顯示:Takotsubo心肌病大鼠心肌組織中超氧陰離子水平顯著增加，NaHS預(yù)處理能夠降低Takotsubo心肌病大鼠心肌組織中超氧陰離子。
　　2.Takotsubo心肌病大

14、鼠血漿及心肌組織中H2O2水平升高。NaHS預(yù)處理可以降低Takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中H2O2水平。
　　3.Takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中MDA水平升高。NaHS預(yù)處理可以降低Takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中MDA水平。
　　4.Takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中GSH水平降低。NaHS預(yù)處理并未升高Takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中GSH水平。
　　5.

15、Takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中SOD活性沒有變化，NaHS預(yù)處理也不改變SOD活性。
　　6.Takotsubo心肌病大鼠心肌組織中NOX4和p67蛋白表達(dá)水平升高， NaHS預(yù)處理可以降低Takotsubo心肌病大鼠心肌組織中NOX4和p67蛋白表達(dá)。
　　7.TUNEL染色結(jié)果顯示：Takotsubo心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量較明顯增加，NaHS可以減少Takotsubo心肌病大鼠心臟組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量。

16、
　　8.Takotsubo心肌病大鼠心肌組織抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，Bax/Bcl-xL比值升高。NaHS增強(qiáng)心肌組織抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，Bax/Bcl-xL比值降低。
　　結(jié)論:
　　1.氧化應(yīng)激參與了Takotsubo心肌病大鼠病理過程，NaHS可以降低Takotsubo心肌病大鼠血漿和心肌組織氧化應(yīng)激水平。
　　2.NaHS通過抑制T

17、akotsubo心肌病大鼠心肌組織NOX4、p67蛋白表達(dá)，從而降低Takotsubo大鼠心肌病氧化應(yīng)激損傷。
　　3.NaHS減輕Takotsubo心肌病大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。
　　第三部分：硫化氫通過抑制p38MAPK/NOX4/ROS通路減輕異丙腎上腺素引起的H9c2細(xì)胞損傷
　　目的：
　　以H9c2細(xì)胞作為研究對象，探討硫化氫對Takotsubo心肌病的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)

18、
　　H9c2細(xì)胞以高糖 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL。置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　2.乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放檢測細(xì)胞毒性
　　H9c2細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，給予不同濃度的ISO（10、50、100、200μM）處理2h，按照試劑盒說明書要求加入試劑，測

19、定490 nm處各孔的吸光度，計(jì)算LDH釋放百分率。以篩選出最小細(xì)胞損傷濃度，選擇ISO100μM用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞給予不同濃度的NaHS(10、50、100、200μM)預(yù)處理，觀察NaHS對ISO100μM處理的H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用，篩選出最佳濃度，選擇NaHS50μM用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　3.CCK8法檢測各組H9c2細(xì)胞活性
　　對數(shù)生長期H9c2細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁后分別給予ISO10

20、0μM處理2h；給予NaHS50μM預(yù)處理30 min后給予ISO100μM處理2h。酶標(biāo)儀檢測在450 nm波長處各孔的OD值。
　　4.DHE染色檢測正常對照組、ISO組及NaHS+ISO組H9c2細(xì)胞超氧陰離子的變化。
　　5.利用Western blot方法檢測正常對照組、ISO組 H9c2細(xì)胞以及NaHS+ISO組H9c2細(xì)胞NOX4蛋白的表達(dá)。
　　6.利用Western blot方法檢測ISO組H9c2細(xì)

21、胞以及 NaHS+ISO組H9c2細(xì)胞p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白的表達(dá)。
　　7.利用Western blot方法檢測給予p38抑制劑 SB203580對 ISO組H9c2細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá)的影響。
　　8.利用Western blot方法檢測給予JNK抑制劑SB600125對ISO組細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.LDH釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H9c2細(xì)胞給予ISO的

22、濃度為100μM時(shí)，細(xì)胞的LDH釋放最多，說明ISO100μM對細(xì)胞的損傷較明顯，選擇ISO100μM作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)濃度。
　　2.LDH釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的NaHS均可以減輕ISO對H9c2細(xì)胞損傷，其中NaHS50μM的保護(hù)作用最為明顯，選擇NaHS50μM用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　3.CCK8實(shí)驗(yàn)顯示NaHS預(yù)處理能夠升高ISO對H9c2細(xì)胞的活力。
　　4.NaHS降低ISO引起的H9c2細(xì)胞超氧陰離子水平。

23、>　　5.NaHS預(yù)處理可降低ISO引起的H9c2細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá)
　　6.NaHS預(yù)處理可降低ISO引起的H9c2細(xì)胞p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)，NaHS及ISO不影響 H9c2細(xì)胞pERK/ERK蛋白表達(dá)。
　　7.p38抑制劑SB203580能夠降低ISO引起的H9c2細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá)
　　8.JNK抑制劑SB600125不影響ISO引起的H9c2細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論

24、：
　　1.ISO可以引起H9c2細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞超氧陰離子水平增加。NaHS可以抑制ISO引起的細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá)和超氧陰離子水平。
　　2.ISO可以引起H9c2細(xì)胞p38蛋白表達(dá)增加和JNK蛋白表達(dá)增加，說明ISO引起p38MAPK通路和JNK通路激活。NaHS可以抑制ISO引起的p38MAPK通路和JNK通路激活。
　　3.ISO是通過激活p38MAPK通路使NOX4蛋白表達(dá)增加，引起細(xì)胞氧化應(yīng)