利用Myf5誘導(dǎo)綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為成肌細(xì)胞的研究.pdf

1、生肌因子5(Myf5)為生肌決定因子(MyoD)基因家族。MyoD基因家族包括生肌決定因子(MyoD)、肌細(xì)胞生成素(Myogenin)、生肌因子5(Myf5)和生肌調(diào)節(jié)因子4(Mrf4)，它們具有單獨(dú)或協(xié)同調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的增殖和分化、肌纖維大小和數(shù)量等功能。為了建立利用小鼠Myf5基因誘導(dǎo)綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為成肌細(xì)胞的方法，本研究在克隆小鼠Myf5基因的cDNA基礎(chǔ)上，依次通過(guò)克隆載體pMD18-T Simple和表達(dá)載體pcDNA3.

2、1(+)相連，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Myf5;采用脂質(zhì)體法將pcDNA3.1-Myf5轉(zhuǎn)染綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞分化形成成肌細(xì)胞的能力。其研究結(jié)果如下：
　　1.Myf5基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　參照GenBank(AK044894)中序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增提取小鼠肌肉組織中的總RNA，擴(kuò)增獲得Myf5基因，與克隆載體pMD18-T Simple相連，通過(guò)雙酶切和測(cè)序鑒定后，與表達(dá)載體pcDNA3.

3、1(+)表達(dá)載體連接。經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果顯示，與理論序列相符，表明成功獲得Myf5基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Myf5;
　　2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分化
　　將冷凍保存的綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其結(jié)果，培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)正常的形態(tài)和生長(zhǎng)曲線;當(dāng)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞約達(dá)到80％匯合時(shí)，分別進(jìn)行下列處理。A組:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myf5無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒，并加入含有0.5％DMSO的F12培養(yǎng)基;B組:轉(zhuǎn)染

4、pcDNA3.1-Myf5無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒，加入F12培養(yǎng)基;C組:含0.5％DMSO的F12培養(yǎng)基。當(dāng)轉(zhuǎn)染后第12d開(kāi)始，在倒置顯微鏡下，3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞均呈現(xiàn)成肌細(xì)胞樣的細(xì)管狀形態(tài)。
　　3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)
　　(1)免疫熒光檢測(cè)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的第17d，將上述3種細(xì)胞和作為對(duì)照未經(jīng)轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用兔MyoD、MyoG、DES抗體處理進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。其結(jié)果，與對(duì)照組不發(fā)生綠色熒光相比，三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞均出現(xiàn)綠色

5、熒光;
　　(2)流式細(xì)胞篩選在轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的第21d，利用BD Accuri-C6個(gè)人型流式細(xì)胞儀對(duì)3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞篩選檢測(cè)，其結(jié)果，三組細(xì)胞中三種基因表達(dá)(Desmin、MyoD、MyoG)都在96.4％以上(A組，98.6％、99.9％、96.9％;B組，99.9％、98.0％、99.1％;C組，97.4％、96.4％、99.9％)
　　(3) Real-Time PCR檢測(cè)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的第28d

6、，對(duì)上述三種細(xì)胞和作為對(duì)照的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)（選取三對(duì)引物分別為MyoG，Myf5和Desmin，一組內(nèi)參引物GAPDH）。其結(jié)果，與轉(zhuǎn)染前細(xì)胞（標(biāo)準(zhǔn)化為1）相比，上述三種處理組的Myf5、MyoG和Desmi的相對(duì)表達(dá)量與均升高（A組分別為5.126±0.01倍、4.315±0.01倍和3.099±0.01倍;B組分別為4.484±0.01倍、3.124±0.01倍和2.889±0.01倍;C組分別為3.321±