基于TLRs對E-Cadherin的調(diào)控探討芒柄花素抗過敏性疾病作用機制研究.pdf

1、在我國，隨著社會的不斷發(fā)展，過敏性疾病的發(fā)病率日漸增高。目前逐漸認識到上皮細胞(Epthelial Cell，EC)在外界條件刺激下分泌的細胞因子胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)和IL-33是關(guān)鍵的啟動因子。）TLR(2、3、4、8、9)配體刺激呼吸道上皮細胞或皮膚角質(zhì)形成細胞可顯著誘導TSLP mRNA的表達升高，同時上皮細胞間E-Cadherin蛋白表達的減少也會導致TSL

2、P表達的升高，那TLRs，E-Cadherin，過敏性疾病關(guān)鍵啟動因子（TSLP和IL-33）之間是否有什么聯(lián)系？TLRs是否可能是通過調(diào)節(jié)E-Cadherin來影響TSLP和IL-33的分泌？此為本論文所要解決問題之一。益氣固表方玉屏風散在緩解期使用可以降低過敏性疾病的復發(fā)，但其中的效應物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制不明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，玉屏風散含藥血清中芒柄花素的含量較高，并發(fā)現(xiàn)在誘導初期給予芒柄花素可顯著減輕小鼠過敏性炎癥癥狀，這說明

3、芒柄花素具有抗過敏的作用且作用在誘導初期。那芒柄花素是如何發(fā)揮作用的呢？其抗過敏的作用機制是什么？本文基于前期研究結(jié)果從以下幾個方面開展研究:
　　1.TLRs對上皮細胞間E-Cadherin的調(diào)控及在過敏性疾病中可能的作用機制
　　(1)研究Toll樣受體(toll-like receptor，TLRs)對上皮細胞間E-Cadherin調(diào)控作用，這種調(diào)控作用是否可能會影響上皮細胞來源的關(guān)鍵促過敏因子TSLP以及IL-33的

4、分泌。通過加入TLR(2、3、4、8、9)的配體刺激16HBE24h后觀察上皮細胞間E-Cadherin的分布與表達，同時檢測上皮細胞來源的關(guān)鍵促過敏因子TSLP和IL-33蛋白以及基因的表達水平。
　　(2)確定其中影響上皮細胞間E-Cadherin的分布與表達的TLRs，對其作用機制深入研究。TLR3和TLR4的配體刺激誘發(fā)多種信號轉(zhuǎn)導途徑，主要包括PI3K和MAPK/NF-κB信號途徑，MAPK/NF-κB信號途徑有三條并行

5、的信號通路，包括p38MAPK信號通路，ERK1/2信號通路以及JNK信號通路。加入ERK1/2抑制劑，p38MAPK抑制劑，JNK1/2/3抑制劑以及PI3K抑制劑，觀察上皮細胞在TLR4和TLR3配體刺激下E-cadheirn的表達。
　　2.TLRs對上皮細胞來源的過敏關(guān)鍵啟動因子TSLP和IL-33蛋白以及基因水平的影響
　　(1)利用小鼠變應性接觸性皮炎(Allergic Contact Dermatitis，AC

6、D)模型以及ACD復發(fā)模型，考察芒柄花素對過敏性炎癥的干預作用以及防復發(fā)的作用。BALB/c小鼠經(jīng)FITC致敏及激發(fā)形成ACD模型，并于該模型誘導初期給予芒柄花素，連續(xù)給藥至d3，于d7激發(fā)后24h測量小鼠雙耳厚度，計算耳腫脹度（右耳厚度-左耳厚度）并比較小鼠左右耳耳重變化，對激發(fā)后24h的耳組織進行病理組織學檢查。在小鼠ACD復發(fā)模型上，緩解期給予芒柄花素，給藥周期10天，于末次給藥結(jié)束后48h再次激發(fā)小鼠，量取小鼠耳厚，計算耳腫脹度

7、，觀察耳組織病理結(jié)構(gòu)改變，并檢測右耳組織勻漿中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13表達水平。
　　(2)考察芒柄花素對上皮細胞來源的致敏關(guān)鍵啟動因子TSLP和IL-33的影響。通過建立小鼠ACD誘導初期模型并在誘導初期給予芒柄花素，檢測小鼠的耳組織中TSLP和IL-33的蛋白以及基因表達水平。在體外用Poly(I∶C)以及LPS刺激支氣管上皮細胞16HBE，觀察芒柄花素對TSLP和IL-33表達的影響。
　　(3)觀察芒

8、柄花素對上皮細胞間E-Cadherin表達與分布的影響，來揭示芒柄花素調(diào)節(jié)關(guān)鍵促過敏因子TSLP和IL-33的表達是否可能與其調(diào)節(jié)上皮細胞間E-Cadherin表達與分布有關(guān)。建立小鼠ACD誘導初期模型以及ACD復發(fā)模型并給予芒柄花素。透射電鏡觀察上皮細胞間的連接，同時檢測小鼠耳組織上皮細胞間E-Cadherin分布與表達。在體外，用TLRs的配體刺激支氣管上皮細胞16HBE，觀察芒柄花素對上皮細胞間E-Cadherin蛋白的調(diào)節(jié)作用。

9、
　　(4)考察芒柄花素對ACD致敏初期TLRs-NF-κB主要信號分子的影響以及對上皮細胞TLR3和TLR4蛋白以及下游信號分子蛋白表達，在體內(nèi)外揭示芒柄花素對上皮細胞間E-Cadheirn蛋白的表達以及分布的調(diào)控是否可能是通過調(diào)節(jié)TLRs以及其下游信號分子來發(fā)揮作用的。在小鼠ACD誘導初期模型給予芒柄花素，檢測小鼠耳組織中了TLRs-NF-κB主要信號分子的表達，觀察芒柄花素對TLRs-NF-κB主要信號分子的影響。體外用Po

10、ly(I∶C)與LPS刺激上皮細胞，檢測TLR3和TLR4蛋白以及下游信號分子蛋白表達。
　　研究結(jié)果:
　　(1)研究發(fā)現(xiàn)TLR3和TLR4激動劑可使上皮細胞間E-Cadherin的分布發(fā)生紊亂，TLR3激動劑可降低E-Cadherin的表達量。用LPS和Poly(I∶C)刺激上皮細胞發(fā)現(xiàn)TSLP和IL-33表達明顯升高，這提示LPS以及Poly(I∶C)可能通過激活TLR4和TLR3來破壞上皮細胞間E-Cadherin繼

11、而使TSLP和IL-33分泌增多。
　　(2)Poly(I∶C)刺激上皮細胞后加入p38MAPK，PI3K，ERK1/2和JNK1/2/3后均上調(diào)E-Cadherin的表達，其中p38MAPK抑制劑和PI3K抑制劑作用最為明顯，提示TLR3對上皮細胞間E-Cadherin的調(diào)節(jié)主要通過p38MAPK和PI3K信號轉(zhuǎn)導途徑。而在LPS的刺激下，加入四個抑制劑后細胞間E-Cadherin的表達與分布都明顯發(fā)生改善，提示TLR4對上皮細

12、胞間E-Cadherin的調(diào)節(jié)與p38MAPK、PI3K、ERK1/2以及JNK1/2/3信號轉(zhuǎn)導途徑均有關(guān)。
　　(3)芒柄花素僅在誘導初期給藥即能良好控制ACD小鼠的耳部炎癥，減輕耳腫脹，改善局部組織充血及炎細胞浸潤等病理改變。在小鼠ACD復發(fā)模型上模擬臨床給藥方案即在緩解期給予芒柄花素，發(fā)現(xiàn)在緩解期連續(xù)10天給予芒柄花素，在第二次攻擊之前停藥48小時，測量小鼠耳腫脹度，芒柄花素可抑制小鼠耳腫脹度，降低耳厚減輕耳重，顯著減少耳

13、組織炎癥細胞浸潤，減輕耳組織充血水腫，芒柄花素還能不同程度降低IL-4、IL-5、IL-13的表達水平。
　　(4)在小鼠ACD誘導初期模型誘導初期給予芒柄花素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型組小鼠的耳組織中TSLP和IL-33的蛋白以及基因水平顯著升高，而給予芒柄花素后能顯著降低TSLP以及IL-33的蛋白和基因表達水平。體外用Poly(I∶C)以及LPS刺激上皮細胞，觀察芒柄花素對TSLP和IL-33表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芒柄花素可

14、抑制TSLP和IL-33的產(chǎn)生，進一步證實芒柄花素誘導初期給藥即能抑制過敏性疾病與調(diào)節(jié)上皮細胞來源的關(guān)鍵促過敏因子TSLP和IL-33的表達水平密切相關(guān)。
　　(5)在小鼠ACD誘導初期模型和ACD復發(fā)模型，發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)FITC致敏和第二次攻擊后，上皮細胞間間隙明顯增大，細胞間連接疏松，E-Cadherin表達量顯著降低且分布發(fā)生紊亂，在致敏初期和緩解期給予芒柄花素后可使上皮細胞間E-Cadherin表達量以及紊亂現(xiàn)象得到改善。體外

15、結(jié)果顯示，上皮細胞在Poly(I∶C)和LPS的刺激下，細胞間E-Cadherin蛋白的分布發(fā)生明顯紊亂，而且Poly(I∶C)還會造成細胞間E-Cadherin蛋白量的改變，給予芒柄花素后，不僅使細胞間的E-Cadherin蛋白的分布得到一定的改善，還能上調(diào)Poly(I∶C)造成的細胞間E-Cadherin蛋白量下降。
　　(6)在小鼠ACD誘導初期模型檢測小鼠耳組織中TLRs-NF-κB主要信號分子的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相

16、比，模型組TLR2，TLR3，TLR4，TLR9，MYD88以及NF-κ3基因水平上升，給予芒柄花素后能下調(diào)TLR3，TLR4，TLR9，MYD88以及NF-κB基因的表達。16HBE細胞在Poly(I∶C)的刺激下，TLR3和TLR4下游的信號分子ERK1/2、p38MAPK、JNK和PI3K的磷酸化與空白組相比明顯增多，而加入芒柄花素后，可顯著下調(diào)TLR3下游信號分子PI3K的磷酸化以及TLR4下游信號分子ERK1/2和p38MAP

17、K的磷酸化，這提示芒柄花素可能是通過調(diào)節(jié)TLR3和TLR4影響其下游信號分子的激活，繼而改善上皮細胞間E-Cadherin的表達與分布。
　　結(jié)論:
　　(1)TLR3主要通過PI3K信號轉(zhuǎn)導途徑影響上皮細胞間E-cadheirn蛋白的表達以及分布，并使促過敏關(guān)鍵細胞因子TSLP和IL-33分泌增多，繼而促進Th2型過敏性疾病。而TLR4對上皮細胞間E-Cadherin的調(diào)控是通過p38MAPK、PI3K、ERK1/2以及J