復雜體系中多目標化合物定性和定量分析技術和策略研究.pdf

1、復雜體系中多目標化合物的定性和定量分析一直是分析化學領域研究的難點。在藥物分析領域，復雜體系分析主要包括了中草藥及中藥組方中有效成分或違禁物質(zhì)的分析，生物樣本中藥物及其代謝產(chǎn)物以及內(nèi)源性代謝物的分析等。一方面這類樣本的成分和基質(zhì)都很復雜，一種中草藥可能就含有成千上百種化學成分，而在生物樣本中更含有種類繁多數(shù)量巨大的內(nèi)源性物質(zhì);另一方面很多目標化合物是微量甚至痕量的，并且結(jié)構是未知的。因此，如何從復雜體系中快速靈敏地發(fā)現(xiàn)并確證已知目標化合

2、物，并且有效排除干擾發(fā)現(xiàn)并鑒定未知的目標化合物，以及實現(xiàn)對微量目標化合物的準確定量一直是近年來研究的熱點。
　　本論文選擇了幾種常見的復雜體系樣本，針對不同的分析目標進行分析技術和分析策略的探索性研究。
　　論文第一部分選擇微量生物樣本的代謝組學分析技術為研究目標，針對目前代謝組學研究面臨的生物樣本微量，但是需要高覆蓋不同豐度和理化性質(zhì)的內(nèi)源性代謝物的需求，建立了一種新的生物樣品前處理方法，該方法首先向100μl血漿或組織勻

3、漿液中加入內(nèi)標溶液和3ml甲醇/甲基叔丁基醚(1∶1，v/v)并渦旋沉淀蛋白，經(jīng)離心后棄去蛋白沉淀，溶液部分加入3.5ml甲基叔丁基醚和1.2ml去離子水后渦旋萃取，脂質(zhì)代謝物被萃取到有機相，極性小分子代謝物被萃取到水相，離心后分別將有機相和水相用氮氣吹干后復溶。該方法可以實現(xiàn)從同一份微量生物樣本(100μl)中同時提取并分離脂質(zhì)和極性小分子內(nèi)源性代謝物。在此基礎上，采用對強極性化合物具有良好保留作用的親水相互作用色譜和靈敏度高、定量準

4、確的三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術新建了靶向極性小分子代謝組學的分析方法，結(jié)合實驗室已有的靶向脂質(zhì)組學分析方法和脂肪酸分析方法，使得生物樣本經(jīng)前處理后可以按照代謝物極性和豐度不同采用上述系列液質(zhì)聯(lián)用分析方法進行分析，形成一個新的基于微量生物樣本的高覆蓋靶向代謝組學分析技術平臺。該平臺實現(xiàn)了同時覆蓋包括脂肪酸代謝、鞘脂代謝、磷脂和甘油酯代謝、氨基酸代謝、能量代謝和核苷酸代謝等主要代謝通路中808種代謝物的靶向分析。
　　采用該平臺基于代謝組

5、學研究了銀杏類提取物（銀杏葉提取物和內(nèi)酯提取物）對心肌缺血損傷大鼠的心臟保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物和內(nèi)酯提取物能夠顯著調(diào)節(jié)由于心肌缺血損傷造成的脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和能量代謝紊亂，發(fā)現(xiàn)了血漿中5種脂肪酸、1種鞘脂、4種磷脂、9種甘油酯、8種氨基酸以及心肌中2種鞘脂、12種磷脂、1種甘油酯、7種極性小分子代謝物可以作為生物標志物，指征銀杏葉提取物的心臟保護作用，發(fā)現(xiàn)了血漿中5種脂肪酸、10種鞘脂、2種磷脂、9種甘油酯、7種極性小分子化

6、合物以及心肌中3種鞘脂、6種磷脂、1種甘油酯、11種極性小分子代謝物可以作為生物標志物，指征內(nèi)酯提取物的心臟保護作用。這種調(diào)節(jié)作用與它們的抗氧化、抗血小板凝集和降血脂的作用有關。
　　為了進一步研究銀杏葉提取物和內(nèi)酯提取物發(fā)揮心臟保護作用的物質(zhì)基礎，進行了體外成分的分析和體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究。首先建立了提取物成分和體內(nèi)代謝產(chǎn)物的液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術的分析方法，該方法可以同時采集提取物和生物樣本中目標化合物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)和多

7、級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。然后經(jīng)過對兩種提取物和大鼠給藥后尿液、糞便、血漿和心肌組織的分析，并采用質(zhì)譜樹狀圖相似度過濾技術尋找代謝物，結(jié)果在銀杏葉提取物中鑒定了六大類48種成分，在銀杏葉提取物給藥大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)18種原型成分和21種甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化代謝物;在內(nèi)酯提取物給藥大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)3種原型成分和1種甲基化代謝物。
　　論文第二部分針對目前保健食品中違禁物質(zhì)種類繁多、不斷出現(xiàn)新的結(jié)構類似物，一種方法很難同時實現(xiàn)發(fā)現(xiàn)、確證和定量多種違禁

8、物質(zhì)的問題，選擇保健食品作為研究對象，建立了一種新的基于高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術和質(zhì)譜樹狀圖相似度過濾技術(MTSF)的保健食品中違禁物質(zhì)的分析策略。第一步，運用67種已知違禁物質(zhì)對照品建立分析方法，該方法前處理采用甲醇超聲提取，色譜柱為資生堂Capcell Core C18（50×2.1mm，2.7μm），流動相為緩沖溶液（含10mM甲酸銨和0.1％乙酸）和乙腈，梯度洗脫，流速:0.3ml/min，柱溫:30℃，進樣量:2μl

9、;質(zhì)譜采用線性離子阱/傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀，ESI離子源，正離子檢測模式，掃描方式為全掃描以及通過數(shù)據(jù)依賴掃描模式對最強和次強的離子進行碰撞誘導解離(CID)獲得三級碎片離子。然后采集每種違禁物質(zhì)對照品的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)和保留時間。第二步，將采集到的已知違禁物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)生成質(zhì)譜樹狀圖，并建立違禁物質(zhì)質(zhì)譜樹狀圖數(shù)據(jù)庫。第三步，待測樣品經(jīng)甲醇超聲提取后采用上述分析方法分析，分析結(jié)果首先通過保留時間和高分辨質(zhì)量數(shù)進行初篩

10、。如果樣品中含有已知違禁物質(zhì)，則采用MTSF技術將樣品中可疑物質(zhì)的質(zhì)譜樹狀圖和數(shù)據(jù)庫中違禁物質(zhì)的質(zhì)譜樹狀圖進行相似度比對，如果相似度得分大于950，則樣品中的違禁物質(zhì)得到確證。并且該違禁物質(zhì)可進一步被定量。第四步，為發(fā)現(xiàn)樣品中含有的未知違禁物質(zhì)，采用MTSF技術將樣品中所有物質(zhì)的質(zhì)譜樹狀圖和數(shù)據(jù)庫中違禁物質(zhì)的質(zhì)譜樹狀圖進行相似度比對。相似度得分大于200的化合物認為是潛在的違禁物質(zhì)。根據(jù)這些潛在的違禁物質(zhì)的質(zhì)譜樹狀圖和精確質(zhì)量數(shù)推導出其

11、結(jié)構，通過購買或者合成對照品后，將其建立到數(shù)據(jù)庫中，從而對新的違禁物質(zhì)進行確證和定量。目前該策略包含抗疲勞、降糖、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)靜催眠、激素和減肥六大類67種違禁物質(zhì)和結(jié)構類似物。通過測定市售的50種保健食品和中藥組方制劑，證明該分析策略快速而且可靠。
　　論文第三部分針對目前蛋白同化激素類興奮劑代謝個體差異大而且復雜，特征代謝物類型、體內(nèi)停留時間和體內(nèi)濃度水平具有個體差異性，陽性結(jié)果不易判斷的瓶頸問題，選擇服藥后人體尿樣作為研究對象，

12、建立了基于高效液相色譜-多反應監(jiān)測技術的興奮劑代謝物發(fā)現(xiàn)新策略。首先建立了司坦唑醇及其代謝物在尿樣中的分析方法，該分析方法采用甲基叔丁基醚提?、裣啻x物，固相萃取法分離Ⅱ相代謝物，色譜柱為Waters SymmetryC18(2.1×100mm，3.5μm)，流動相為0.1％甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫，流速:0.3ml/min，柱溫:35℃，進樣量:5μl。質(zhì)譜采用三重四極桿質(zhì)譜， ESI離子源，正離子檢測模式，掃描模式為多反應檢測(M

13、RM)。其次，以司坦唑醇其主要代謝物的特征碎片離子作為子離子，根據(jù)可能的Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應類型推測母離子，通過MRM掃描在尿樣中全面尋找司坦唑醇的代謝物，特別是未知的和低濃度的代謝物。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)司坦唑醇Ⅰ相代謝物27種，Ⅱ相代謝物21種，其中14種Ⅰ相代謝物和14種Ⅱ相代謝物未見文獻報道，9種代謝物在停藥后15天仍可在尿液中檢測到。因此該策略可有效用于表征蛋白同化激素類興奮劑的體內(nèi)代謝輪廓并發(fā)現(xiàn)其未知和長時間停留的代謝物，延長其檢測窗口