白細胞介素-1β對自身免疫性甲狀腺疾病發(fā)病影響的研究.pdf

1、自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)主要包括 Graves’病(GD)和橋本甲狀腺炎(HT)兩種類型。兩種疾病都受特定甲狀腺自身抗原,如甲狀腺過氧化物酶(TPO)甲狀腺球蛋白(TG),和/或 TSH受體(TSHR)的自身抗體(aAbs)的作用。GD和 HT中的甲狀腺功能亢進癥/減退癥可以視為 AITD連續(xù)譜的兩端，兩種疾病在該連續(xù)譜中存在大量的重疊區(qū)間。不僅在幾乎所有 HT患者中 TPOAb和/或 TGAb滴度增高,而且在70％的 GD患者

2、中這兩種抗體滴度也增高。甲狀腺功能減退癥源于長期慢性自身免疫性甲狀腺炎， Graves’甲亢患者使用抗甲狀腺藥物進入緩解后最終有多達20%的患者轉(zhuǎn)變?yōu)榧谞钕俟δ軠p退癥;阻斷 TSHRAb對于甲狀腺功能減退癥的發(fā)病貢獻了三分之一,而慢性自身免疫性甲狀腺炎貢獻了其余的三分之二。
　　甲狀腺除了分泌甲狀腺激素以外還能產(chǎn)生一系列免疫活性因子，如粘附分子、生長因子、炎癥介質(zhì)（一氧化氮和前列腺素），當然還有細胞因子。除了對靶細胞的生長和分化發(fā)

3、揮關(guān)鍵作用以外，這些分子還調(diào)節(jié)許多甲狀腺疾病的易感性。據(jù)報道，許多細胞因子,包括 IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13和 IL-15由甲狀腺細胞合成,其中 IL-1可以刺激甲狀腺細胞增殖并抑制甲狀腺激素的合成和釋放的幾個步驟。它也刺激甲狀腺產(chǎn)生其他細胞因子，如 IL-6和 IL-8，破壞甲狀腺上皮屏障，并影響甲狀腺細胞功能。實際上，IL-1下調(diào)甲狀腺特異性蛋白，如 Tg和 TPO的表達,抑制碘化作用和 Na+/I

4、-同向轉(zhuǎn)運體(NIS),并減少甲狀腺激素向血循環(huán)的釋放。IL-1家族由 IL-1α, IL-1β,和 IL-1受體拮抗劑(IL-1Rα)組成。IL-1β主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生,它與 IL-1α具有類似的結(jié)構(gòu)和生物活性，是人類IL-1家族的主要成員。
　　到目前為止, IL-1β在AITD中的病理生理學(xué)和診斷學(xué)意義仍然尚不明確。在本研究中,我們檢測了 HT,GD患者和正常對照組的血清IL-1β水平,發(fā)現(xiàn)并無統(tǒng)計差異。而外周血單個核

5、細胞(PBMC)中，HT組IL-1βmRNA和蛋白水平均明顯高于 GD和正常對照組。此外, HT患者甲狀腺組織的 IL-1βmRNA水平也高于GD患者,這可能與 HT患者的甲狀腺組織局部浸潤更多的的單核細胞也有關(guān)系。臨床資料的相關(guān)分析證實了IL-1β的高表達與 HT的發(fā)病機制相關(guān)。這些結(jié)果提示：IL-1β是參與橋本甲狀腺炎發(fā)病機質(zhì)的一個活躍的因子，可能會成為一種很有前途的診斷/治療靶點。
　　材料與方法：
　　1.患者

6、>　　本研究納入自2013年6月至2014年11月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的患者，其中新診斷的女性 HT患者12例，年齡20至52歲(平均年齡37.58±9.29歲)；女性 GD患者12例，年齡25至51歲（平均年齡37.92±9.89）；20名正常女性志愿者作為正常對照組，年齡18至50歲(平均年齡34.35±9.32歲)。
　　2.血液樣本和甲狀腺組織切片采集
　　采集患者和志愿者的外周血樣本，轉(zhuǎn)速200×g，4℃

7、離心5分鐘,收集上層血清并儲存在-80℃冰箱中用于 IL-1β的檢測。使用標準 Ficoll-Hypaque以密度離梯度方法離心分離獲得 PBMC，加入 Trizol，儲存于-80℃冰箱內(nèi)用于提取總 RNA。收集甲狀腺腺瘤旁正常甲狀腺組織標本, HT和 GD的甲狀腺組織標本儲存在液氮中。
　　3.免疫組織化學(xué)
　　將石蠟包被的甲狀腺組織制成5μm厚度的切片，使用二甲苯脫蠟。用微波方法30分鐘作用于透明的切片完成抗原修復(fù)。以稀

8、釋的正常山羊血清封閉。用0.3%過氧化氫-甲醇處理切片，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。目標抗原使用1:100抗-CD14(Abcam)或1:150抗-CD64(Abcam)孵育過夜用以檢測。一抗標記過后使用帶有辣根過氧化物酶的二抗( Santa Cruz Biotechnology)和3,3′-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(Life Technologies)著色。切片使用蘇木精復(fù)染色,然后清洗并固定。
　　4.引物設(shè)計和反應(yīng)條件
　　根據(jù)

9、Genbank序列,使用 Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)和服務(wù)公司合成引物。所有引物序列見正文表1。
　　5.RNA的提取及 cDNA的合成
　　按照試劑盒制造商的說明書，使用 Trizol(Ambion, Carlsbad, CA, USA)從 PBMC和甲狀腺組織中提取總 RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, C

10、A, USA)合成cDNA.。所有 RNA樣本予65 ℃加熱10分鐘使得二級結(jié)構(gòu)模板變性然后立即在冰上冷卻5分鐘。總 RNA參照之前的文獻報道進行逆轉(zhuǎn)錄[17]。
　　6.Real-time PCR分析
　　使用 Trizol從 PBMC或甲狀腺組織中提取總 RNA。取1μg總 RNA合成 cDNA,按照試劑盒說明書步驟，分別加入各自引物及 iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad

11、 Laboratories, USA)，使用 Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR系統(tǒng)(Life Technologies, USA)檢測 mRNA的表達水平?；虮磉_量用2–△△Ct相對量表示。目的基因表達水平以β-actin作為內(nèi)參進行標準化，結(jié)果以和內(nèi)參相比較的循環(huán)數(shù)（Ct）差值來體現(xiàn)。
　　7.血清 IL-1β的 Quantiglo ELISA測定
　　按照試劑盒制

12、造商的說明書(R&D Systems, Catalog Number QLB00B,USA)，采用 Quantiglo ELISA方法測定血清 IL-1β水平。所有樣本均檢測三次。
　　8.化學(xué)發(fā)光法測定血清T3，T4，TSH，ATG和TPOAb
　　按照試劑盒制造商的說明書(SIEMENS ADVIA Centaur XP Immunoassay System, USA)采用化學(xué)發(fā)光法測定血清 T3， T4， TSH， A

13、TG和 TPOAb水平。所有樣本均檢測三次。
　　9.放射免疫分析法測定血清TSHRAb
　　按照試劑盒制造商的說明書(Union Medical Science&Technology Co., Ltd., Tianjin,China)采用放射免疫分析法測定血清 TSHRAb水平。所有樣本均檢測三次。
　　10.流式細胞檢測分析
　　采用 BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Per

14、meabilization試劑盒(BD Biosciences, Oxford, UK)進行細胞預(yù)處理及染色。
　　按照試劑盒說明書,細胞采用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗-CD64抗體(BD Pharmingen)染色，然后使用藻紅蛋白(PE)標記的抗-IL-1?抗體(BD Pharmingen)胞內(nèi)染色。使用 Beckman FC500流式細胞分析儀(Cytomics FC500, Beckman Coulter, Bre

15、a, CA, USA)檢測待測細胞,獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用 Beckman FC500CXP軟件進行分析。
　　11.統(tǒng)計學(xué)分析
　　使用 SPSS17.0(SPSS, Chicago, IL, USA)軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。在正文及圖表中，數(shù)據(jù)以均值±標準差(S.D.)的形式呈現(xiàn)。采用合適的Student’st檢驗的方法比較組間配對的或非配對數(shù)據(jù)。對于非參數(shù)數(shù)據(jù),采用 Mann–Whitney檢驗分析組間差異。采用 Pea

16、rson相關(guān)分析測試兩個連續(xù)變量之間的相關(guān)性。p<0.05被視為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.HT組與 GD組和正常對照組相比，PBMC中的IL-1β表達增高
　　正如之前所述,目前認為多種促炎細胞因子參與了AITD的發(fā)病機制。我們采用 qRT-PCR分析方法檢測了AITD患者及正常對照 PBMC中一系列 Th1/Th2細胞因子以及 IL-1β的mRNA水平。結(jié)果顯示三組間 IL-4,INF-γ, TNF-α和

17、 IL-13 mRNA水平無顯著性差異,而 HT組 PBMC中的 IL-1β的 mRNA水平顯著增高，幾乎是 GD組的3倍。而 GD組 PBMC中的 IL-1β的mRNA又幾乎是正常對照組的7倍。這意味著,兩組 AITD患者（ GD和HT） PBMC中的IL-1βmRNA水平與正常對照相比均增高。
　　此外,我們還檢測了 GD組、 HT組和正常對照組 PBMC中的 IL-1β蛋白水平。PBMC細胞采用 CD64和 IL-1β雙抗體

18、染色，然后通過流式細胞術(shù)進行分析。HT組(n=9) PBMC中 IL-1β/CD64的比例為67.17%~98.49%，明顯比 GD組(n=7)的23.19%~51.35%和正常對照組(n=8)的5.22%~18.42%高。此結(jié)果與之前的 qPCR數(shù)據(jù)相吻合。這些結(jié)果顯示：無論是在 mRNA水平還是在蛋白水平， HT組 PBMC中的 IL-1β均明顯高于 GD組，而正常對照組 PBMC中的 IL-1β是最低的。
　　2.HT組、G

19、D組和正常對照組的血清 IL-1β水平無顯著性差異
　　我們采用 Quantiglo ELISA分析進一步檢測了 HT組(n=12), GD組(n=12)患者和正常對照組(n=20)血清中的 IL-1β蛋白水平。與 PBMC中所得到的數(shù)據(jù)不同, HT組, GD組和正常對照組血清 IL-1β水平分別為0.47360±0.21313 pg/mL,0.46241±0.05170 pg/mL和0.52672±0.13024 pg/mL，三

20、組間無顯著性差異。
　　3.HT組與 GD組和正常對照組相比，甲狀腺組織中的 IL-1β表達量明顯增高
　　除了對 PBMC中 IL-1β的水平進行檢測以外，我們還進一步采用 qRT-PCR方法分析了 HT、 GD患者及甲狀腺腺瘤患者（取腺瘤周圍正常甲狀腺組織）甲狀腺組織中 IL-1β的表達水平。與PBMC中的研究數(shù)據(jù)一致的是,研究結(jié)果顯示： IL-1βmRNA在GD甲狀腺組織中的水平幾乎僅僅是 HT甲狀腺組織中的一半,而

21、GD患者與甲狀腺腺瘤患者之間甲狀腺組織中的 IL-1βmRNA水平無顯著性差異。這一結(jié)果與 Giordano C等采用免疫組化方法證實的 HT患者甲狀腺組織中 IL-1β高水平表達的結(jié)果相一致。
　　此外，我們還采用免疫組化分方法對于甲狀腺組織中單核-巨噬細胞的浸潤情況進行分析。IL-1β主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生，我們分別采用 CD64和 CD14抗體對單核-巨噬細胞進行免疫標記。HT患者甲狀腺組織樣本切片陽性染色細胞浸潤明顯超過

22、了GD樣本和甲狀腺腺瘤周圍正常甲狀腺組織樣本。
　　4.L-1β水平與HT組和GD組患者臨床指標的相關(guān)性分析
　　為了探索不同IL-1β水平在AITD患者中發(fā)揮的潛在作用，該分析招募了12名女性GD患者，12名女性HT患者，以及20名女性正常對照者。各組間在年齡分布上無顯著性差異。各組間血清 T3,T4,TSH, ATG以及TPOAb水平存在顯著性差異（所有提到的指標，p<0.05），這與各組的診斷相映證。我們將每個組的數(shù)據(jù)

23、分別單獨分析，發(fā)現(xiàn)血清 IL-1β水平以及PBMC IL-1β水平與這些血清學(xué)指標均無相關(guān)性。然而，將所有3組數(shù)據(jù)集中分析，發(fā)現(xiàn) PBMC IL-1βmRNA水平與血清ATG(r=0.711,p<0.001)及血清 TPOAb(r=0.713, p<0.001)呈正相關(guān)?？傊狙芯拷Y(jié)果提示 PBMC中的 IL-1β水平與血清ATG及TPOAb水平呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　我們的研究表明, IL-1β參與自身免疫性甲狀腺疾