Rep蛋白介導(dǎo)的定點整合系統(tǒng)順式元件研究及應(yīng)用.pdf

1、促進外源治療基因定點整合至宿主基因組，既能克服隨機插入所導(dǎo)致的功能基因斷裂、原癌基因激活、染色體缺失、重排等潛在危險，又可以達到使治療基因長期表達的目的，是較為理想的基因治療策略。腺相關(guān)病毒是一種非致病性的細小病毒，因其具有將自身基因組定點整合至人類染色體的特性，已被發(fā)展為基因治療載體用于許多疾病的治療。腺相關(guān)病毒的整合機制可以用于指導(dǎo)外源基因定點整合至人類基因組19號染色體特定區(qū)域(19q13．3-qter)：AAVSl位點，因此對腺

2、相關(guān)病毒的整合機制的研究也具有重要的意義。目前已知腺相關(guān)病毒的Rep68／78蛋白為介導(dǎo)定點整合所必需，而病毒基因組中所需的與整合相關(guān)的核心順式元件尚無定論。普遍認(rèn)為ITR是腺相關(guān)病毒整合所需順式元件，近年來有研究表明P5整合效率元件(P5IEE)也可介導(dǎo)質(zhì)粒發(fā)生依賴于Rep蛋白的高效定點整合。 我們以EGFP和Neo基因為報告基因構(gòu)建了一系列攜帶不同整合順式元件的質(zhì)粒，與rep基因表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞后，通過對細胞克隆形成

3、效率及基因組整合位點的Southernblot檢測來確定腺相關(guān)病毒定點整合系統(tǒng)的核心順式元件。我們發(fā)現(xiàn)在Rep蛋白存在的情況下，16bp的RBE元件即可以介導(dǎo)質(zhì)粒發(fā)生針對AAVSl位點的整合，并且位于ITR內(nèi)的RBE(rrR)元件比位于P5IEE內(nèi)的RBE(p5)元件具有更高的效率及位點專一性，這一發(fā)現(xiàn)提示了RBE很可能是腺相關(guān)病毒具有定點整合能力的根本原因。對P5整合效率元件(P5IEE)的缺失分析表明隨著P5IEE從5’端逐漸缺失，

4、介導(dǎo)克隆形成和定點整合的效率都有所下降，尤其是前89bp缺失后介導(dǎo)克隆形成效率與完整的P5IEE相比出現(xiàn)顯著差異，介導(dǎo)整合的特異性也明顯下降，說明P5IEE中前89bp中具有與整合相關(guān)的結(jié)構(gòu)或序列。對整合質(zhì)粒與基因組接合區(qū)序列特征的分析表明質(zhì)粒斷裂部位多位于RBE序列附近；部分質(zhì)粒與基因組接合點附近插入了不同長度的未知DNA序列。這些結(jié)構(gòu)特征與野生型腺相關(guān)病毒整合至基因組時的序列特征相似，說明RBE順式元件所介導(dǎo)的質(zhì)粒定點整合與野生型腺

5、相關(guān)病毒整合是通過同一套整合機制。 為了進一步在活體實驗中探討是否可以通過此定點整合系統(tǒng)使治療基因定點整合至小鼠基因組內(nèi)，長期表達功能蛋白，我們以凝血因子IX(hFIX)為報告基因構(gòu)建了攜帶整合順式元件ITRRBE的質(zhì)粒，通過尾靜脈液壓法將此質(zhì)粒與rep基因表達質(zhì)粒一起導(dǎo)入攜帶AAVSl的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)。質(zhì)粒pRBE—CMVhFIX與rep基因表達質(zhì)粒共注射后hFIX在小鼠體內(nèi)高水平表達，l天時hFIX表達水平為2588~203

6、ng／m1血漿，此后開始逐漸下降，80d后穩(wěn)定在150～204ng向l水平，持續(xù)時間超過240天；與不攜帶任何整合元件的對照質(zhì)粒pN2一CMVhFIX相比，對照組起初同樣得到高水平的hFIX表達，之后迅速下降，150天后血漿中已基本檢測不到hFIX蛋白。PCR的結(jié)果顯示DNA注射后1天hFIXDNA在多組織中都有分布；30天時觀察到對照組外源DNA丟失的速度要高于pRBE—CMVhFIX注射組，除了肝臟外，其余器官hFIX信號均已大幅度

7、減弱；240d時對照組所有器官中都檢測不到hFIXDNA特異帶，而pRBE-CMVhFIX注射組在心、肝、腎中仍能檢測到hFIXDNA。對各組織RT一PCR的檢測反映hFIX主要在小鼠肝臟中長期表達，時間超過240天。谷草及谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平與病理切片檢測表明除尾靜脈液壓法造成的短期急性肝損傷現(xiàn)象以外沒有觀察到Rep蛋白引起另外的細胞毒性。 本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實了在Rep蛋白存在的情況下，16bp的RBE元件即可以介導(dǎo)質(zhì)粒發(fā)生針對A