異甘草酸鎂對(duì)放射性肺損傷的改善作用及其機(jī)制初步研究.pdf

1、研究目的：
　　放射治療是胸部腫瘤常規(guī)治療方法之一，而放射性肺損傷(radiation induced lung injury，RILI)是放療的常見不良反應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，接受放療的肺癌患者中，放射性肺損傷的發(fā)生率約20％。雖然近幾年放療技術(shù)水平大幅進(jìn)步，但RILI的發(fā)生率仍沒有下降趨勢(shì)。臨床上放射性肺損傷的治療藥物雖多種多樣，但目前仍缺乏效果佳、副作用少的藥物。
　　異甘草酸鎂為第四代甘草酸制劑，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)

2、、保護(hù)細(xì)胞膜等生理活性，臨床主要用于慢性病毒性肝炎、急性藥物性肝損傷的治療。近來，研究證明，異甘草酸鎂可改善百草枯或博來霉素引起的肺損傷和肺纖維化，但其是否對(duì)放射性肺損傷有保護(hù)作用，目前尚無報(bào)道。因此本研究旨在探討異甘草酸鎂對(duì)放射性肺損傷的改善作用并初步探索其作用機(jī)制。
　　研究方法：
　?。ㄒ唬┊惛什菟徭V對(duì)小鼠放射性肺損傷的改善作用
　　1.動(dòng)物模型的建立：采用60Co源γ射線15Gy單次照射C57BL/6雌性小鼠全

3、胸，分別至照射后4周、8周、12周處死小鼠。
　　2.動(dòng)物分組和給藥：150只C57小鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、輻照組、異甘草酸鎂組、異甘草酸鎂治療組和地塞米松治療組，每組30只。各組小鼠于造模前2h及造模后每日腹腔給藥：IR+MgIG組和MgIG組注射MgIG(100mg/kg);IR組和Control組注射生理鹽水(20mL/kg);IR+DXM組注射DXM(0.5mg/kg)。
　　3.檢測：①觀察小鼠全身情況（活動(dòng)、精

4、神狀態(tài)、體重、胸部皮毛）;②肺臟大體情況、HE染色和Masson染色觀察肺組織病理變化，并對(duì)肺泡炎癥程度、纖維化程度進(jìn)行評(píng)分;③采用免疫組化法檢測小鼠肺組織collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA、fibronectin、TGF-β1、p-smad2、p-smad3、Nox4、p-p38和p-AKT蛋白表達(dá)水平;④采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測肺組織α-SMA、fibronectin和TGF-β1mRNA水平;⑤采用ELISA法檢測

5、血清TGF-β1含量;⑥采用生化法測定肺組織MDA含量、SOD活力和GSH-PX活力。
　　（二）異甘草酸鎂調(diào)控p38/AKT/Nox4抑制電離輻射誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞分化
　　1.細(xì)胞分化模型的建立：采用60Co源γ射線8Gy單次照射肺成纖維細(xì)胞株(HFL-1)，給予細(xì)胞異甘草酸鎂(0.01mg/mL)預(yù)處理24h，照射后72h收集細(xì)胞。
　　2.檢測：①CCK-8法檢測輻照后細(xì)胞增殖率;②western blot法檢測

6、細(xì)胞內(nèi)a-SMA、fibronectin、Nox4、p-p38和p-AKT蛋白表達(dá)水平;③免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)a-SMA、fibronectin蛋白表達(dá)水平;④流式細(xì)胞術(shù)法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。
　　研究結(jié)果：
　?。ㄒ唬┊惛什菟徭V對(duì)小鼠放射性肺損傷的改善作用
　　1.小鼠經(jīng)15Gy全胸輻射后，逐漸出現(xiàn)精神萎靡，行動(dòng)減慢，皮毛暗沉，脫毛。造模2周后，動(dòng)物精神狀態(tài)和活動(dòng)慢慢恢復(fù)。輻照后8周左右，小鼠胸部出現(xiàn)不同程度白毛。

7、經(jīng)異甘草酸鎂和地塞米松分別治療后，小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)和胸部毛發(fā)變白情況有所緩解。
　　2.輻照后4周，小鼠肺表面呈現(xiàn)出血點(diǎn)，輻照后8、12周雙肺表面充血嚴(yán)重，彈性較差。異甘草酸鎂和地塞米松分別治療后，小鼠雙肺情況均有所改善。
　　3.輻照后1周，各輻照組小鼠均出現(xiàn)體質(zhì)量下降。相較于正常對(duì)照組，單純輻照組小鼠體質(zhì)量下降明顯(P＜0.05)，而相較于單純輻照組，異甘草酸鎂治療組體質(zhì)量較高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，地塞米

8、松治療組與單純輻照組小鼠體質(zhì)量無明顯差異。2周以后，各輻照組小鼠體質(zhì)量逐漸回升。輻照后8周和12周，單純輻照組小鼠體質(zhì)量明顯小于正常對(duì)照組（P＜0.05），異甘草酸鎂處理組體質(zhì)量明顯大于單純輻照組(P＜0.05)，地塞米松處理組明顯小于單純輻照組(P＜0.05)。
　　4.輻照后4周，肺組織以炎癥變化為主。輻照后8、12周，肺組織以炎癥以及纖維化灶形成為主。肺泡炎和纖維化評(píng)分：相較于正常對(duì)照組，單純輻照組分?jǐn)?shù)明顯增加(P＜0.05

9、)。經(jīng)異甘草酸鎂和地塞米松分別治療后，肺組織炎癥和纖維化病變皆有緩解，肺泡炎和纖維化評(píng)分較單純輻照組低(P＜0.05)。
　　5.免疫組化結(jié)果顯示輻照后小鼠肺組織collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA、fibronectin、TGF-β1、p-smad2、p-smad3、Nox4、p-p38和p-AKT蛋白表達(dá)水平皆增加，經(jīng)異甘草酸鎂和地塞米松分別治療后上述蛋白水平皆降低。
　　6.輻照后12周，異甘草酸鎂治療組

10、和單純輻照組肺組織α-SMA mRNA表達(dá)水平存在明顯差異(P＜0.05)，而fibronectin基因表達(dá)水平差異不明顯(P＞0.05)。
　　7.照射后4周、8周和12周，肺組織MDA含量皆升高而SOD、GSH-PX活力皆降低，與正常對(duì)照組相較，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。經(jīng)異甘草酸鎂和地塞米松治療后，各時(shí)間點(diǎn)肺組織MDA含量與單純輻照組相比明顯減少(P＜0.05)，SOD、GSH-PX活力明顯升高（P＜0.05）。<

11、br>　　8.照后4周，8周，12周，血清中TGF-β1含量和肺組織TGF-β1mRNA皆增加(P＜0.05與Control組相比)，經(jīng)異甘草酸鎂和地塞米松分別治療后上述指標(biāo)表達(dá)降低，與單純輻照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　9.異甘草酸鎂治療組和地塞米松治療組之間，小鼠體質(zhì)量，α-SMA mRNA表達(dá)以及輻照后8周SOD活力存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;肺泡炎、纖維化評(píng)分，血清TGF-β1含量，肺組織TGF-β1mRNA水平皆無明顯統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)差異。
　?。ǘ┊惛什菟徭V調(diào)控p38/AKT/Nox4抑制電離輻射誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞分化
　　1.8Gyγ射線照射對(duì)肺成纖維細(xì)胞的增殖無明顯影響(P＞0.05與Control組相比)。0.0001～0.01mg/mL異甘草酸鎂處理細(xì)胞，其增殖率與正常對(duì)照組及單純輻照組比無明顯差異(P＞0.05)，僅0.1mg/mL異甘草酸鎂可明顯抑制細(xì)胞的生長(P＜0.05與Control組及IR組相比)。
　　2.8Gyγ射線照射

13、可顯著增加肺成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)，而異甘草酸鎂可明顯抑制輻照增加的α-SMA表達(dá)，其作用呈劑量依賴性。
　　3.免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示：照射后72h，肺成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA和fibronectin蛋白表達(dá)增加。異甘草酸鎂可抑制電離輻射的這一效應(yīng)。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：輻照后1h，單純輻照組細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。相較于單純輻照組，異甘草酸鎂治療組平均熒光強(qiáng)

14、度明顯降低（P＜0.05）。
　　5.Western blot結(jié)果顯示：輻照后72h，單純輻照組相較于正常對(duì)照組Nox4蛋白表達(dá)水平明顯增加(P＜0.05)。與模型組相比，異甘草酸鎂治療組Nox4蛋白水平降低。輻照后1h，細(xì)胞磷酸化p38、AKT水平顯著增高(P＜0.05與Control組相比)。加入異甘草酸鎂后，與模型組比，輻照細(xì)胞內(nèi)p38、AKT磷酸化蛋白水平顯著降低(P＜0.05)。
　　6.Western blot結(jié)

15、果顯示：輻照后72h，經(jīng)Nox4和磷酸p38、AKT抑制劑預(yù)處理的肺成纖維細(xì)胞胞內(nèi)α-SMA和fibronectin蛋白表達(dá)均顯著減少(P＜0.05與IR組相比)。與單純輻照組比，異甘草酸鎂顯著減少輻照細(xì)胞內(nèi)α-SMA和fibronectin蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　7.Western blot結(jié)果顯示：輻照后72h，經(jīng)siNox4預(yù)處理的肺成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA和fibronectin蛋白表達(dá)顯著減少(P＜0.05與IR組

16、相比)，且異甘草酸鎂減少已敲低Nox4的輻照細(xì)胞內(nèi)α-SMA和fibronectin蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)論：
　　1.成功建立小鼠放射性肺損傷模型。
　　2.異甘草酸鎂對(duì)放射性肺損傷有保護(hù)作用。其作用可能與調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低TGF-β1及其通路smad2/3的表達(dá)，抑制p38/AKT/Nox4通路等機(jī)制有關(guān)。
　　3.異甘草酸鎂可明顯抑制輻照引起的肺成纖維細(xì)胞分化，其作用與干預(yù)p38/AKT/Nox4通路有