Atg161L1變異體與細(xì)胞自噬的關(guān)系.pdf

1、目的:探討自噬基因Atg16L1基因變異體與自噬功能的關(guān)系。
　　 方法:首先，采用生物信息學(xué)方法，以基因組DNA序列、cDNA序列和EST數(shù)據(jù)為依據(jù)，搜索Pfam數(shù)據(jù)庫、PSIPRED數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫等，對(duì)Atg16L1變異體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析并對(duì)其進(jìn)行克隆。第二，采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察Atg16L1變異體在細(xì)胞內(nèi)自噬泡、溶酶體和線粒體上的定位情況。第三，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，過表達(dá)Atg16L1變異體和GFP-LC3，分析L

2、C3的酯化變化，進(jìn)一步探討Atg16L1變異體對(duì)細(xì)胞自噬的影響。
　　 結(jié)果:(1)人Atg16L1基因可編碼七種剪接變異體，其中野生型Atg16L1基因編碼607氨基酸，包含coiled-coil區(qū)域和七段WD repeats重復(fù)結(jié)構(gòu)域。Swiss-PdbViewer4.0.4軟件對(duì)其變異體分析指出，Atg16L1剪接變異體的差異主要存在于coiled-coil區(qū)域中。本文已獲得Atg16L1三種變異體:Atg16L1-1蛋白

3、包含全長(zhǎng)607氨基酸，包含coiled-coil區(qū)域和七段WD repeats重復(fù)結(jié)構(gòu)域;Atg16L1-2蛋白缺失外顯子8序列相對(duì)應(yīng)的區(qū)域;Atg16L1-3蛋白缺失coiled-coil區(qū)域。(2)細(xì)胞亞定位結(jié)果分析指出，Atg16L1-1與MDC（Monodansylcadaverine，一種自噬示蹤劑，簡(jiǎn)稱MDC）追蹤的自噬泡共定位陽性點(diǎn)數(shù)為28.0±2.58 dots，高于Atg16L1-2(15.75±1.71 dots)和

4、Atg16L1-3(3.75±0.75 dots)(P＜0.001)。Atg16L1-1與溶酶體共定位陽性點(diǎn)數(shù)為37.67±1.75dots，高于Atg16L1-2（23.14±2.27 dots）和Atg16L1-3（13.0±1.58 dots）（P＜0.001）。Atg16L1-1和Atg16L1-3均可定位于線粒體，其相應(yīng)的共定位陽性點(diǎn)數(shù)分別為14.33±1.53/cell和7.67±1.53/cell（P＜0.01），Atg1

5、6L1-2沒有在線粒體上定位。(3)過表達(dá)Atg16L1變異體對(duì)細(xì)胞自噬產(chǎn)生影響。共轉(zhuǎn)染Atg16L1-1變異體和GFP-LC312h后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ平均陽性點(diǎn)數(shù)（70.2±2.39 dots）高于Atg16L1-2(59.25±2.22 dots)和Atg16L1-3（48.25±2.22 dots）（P＜0.001）。共轉(zhuǎn)染Atg16L1-1變異體和GFP-LC324h后LC3-Ⅱ平均陽性點(diǎn)數(shù)均有不同程度降低，其平均陽性點(diǎn)數(shù)