脈沖電磁場對雪旺細胞的激活作用及其在周圍神經(jīng)損傷修復中的應用.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷是臨床上常見的創(chuàng)傷類型，尤其是長節(jié)段的神經(jīng)缺損一直是最為棘手的治療難題之一。雖然自體周圍神經(jīng)移植可以促進神經(jīng)再生并恢復一定的功能，然而自體神經(jīng)移植具有很大的局限性，如二次手術(shù)損傷和供區(qū)感覺等功能的缺失。此外，供體神經(jīng)來源有限以及供、受體神經(jīng)直徑不匹配等因素也限制了自體神經(jīng)移植的應用。越來越多的學者嘗試用組織工程神經(jīng)支架來修復神經(jīng)缺損，而對于長節(jié)段的神經(jīng)缺損，單純依靠支架材料進行修復往往存在神經(jīng)生長時間過長，靶肌肉萎縮程度嚴重

2、等現(xiàn)象，修復效果并不理想。大量研究表明，在神經(jīng)修復材料局部構(gòu)建良好的生物學微環(huán)境，是決定神經(jīng)缺損修復效果的關(guān)鍵。有研究表明將種子細胞復合在神經(jīng)支架內(nèi)部，可改善神經(jīng)再生的微環(huán)境，起到有效的促神經(jīng)再生作用。雪旺細胞作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細胞，在周圍神經(jīng)損傷的修復中具有非常重要的作用，也是最常用的種子細胞之一。然而，雪旺細胞經(jīng)分離培養(yǎng)后，其合成及分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞粘附分子的能力顯著下降，不能持續(xù)、高效的合成神經(jīng)營養(yǎng)因子等有利于神經(jīng)再生

3、的分子，在一定程度上限制了雪旺細胞構(gòu)建神經(jīng)支架局部生物學微環(huán)境的能力。因此需要尋找一種能方便、有效激活雪旺細胞，使其保持生物活性的技術(shù)來解決上述問題。有研究表明，電磁場作為一種安全、經(jīng)濟、無創(chuàng)、易實施的物理方法，可有效的調(diào)節(jié)多種細胞的生物學性能，包括分化、增殖、凋亡、伸展和遷移等，并且可以促進神經(jīng)元突起的生長，延緩靶肌肉的萎縮，加速創(chuàng)傷愈合等。本研究應用脈沖電磁場（2.0 mT；50Hz）干預雪旺細胞4小時，發(fā)現(xiàn)可促進雪旺細胞的增殖并激

4、活其合成、分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF，GDNF，VEGF），并進一步通過體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，將雪旺細胞與神經(jīng)導管相復合，同時輔以脈沖電磁場進行實時刺激，可有效促進大鼠12mm坐骨神經(jīng)缺損的修復，提示了脈沖電磁場可通過激活移植雪旺細胞等作用，從而促進神經(jīng)的再生和功能的恢復。
　　第一部分脈沖電磁場參數(shù)的選擇及其對雪旺細胞的激活效應
　　目的：篩選最佳的磁場參數(shù)，探究脈沖電磁場對雪旺細胞生物學行為的影響。
　　方法：將接種的

5、雪旺細胞分為5組，依次以0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mT；50 Hz
　　的脈沖磁場分別干預各組細胞4小時。24小時后使用流式細胞技術(shù)檢測雪旺細胞的凋亡，掃描電鏡觀察雪旺細胞的形態(tài)，根據(jù)檢測結(jié)果篩選最佳磁場強度。隨后在最佳磁場參數(shù)下分別刺激雪旺細胞（0.5、1、2、3、4、5、6和8小時），刺激完成后的24和48小時應用CCK-8檢測雪旺細胞的活性，以確定磁場的干預時間。
　　將雪旺細胞在2.0 mT；50Hz

6、的磁場參數(shù)下作用4小時，采用EdU-labeling量化分析磁場作用后12小時、24小時雪旺細胞的增殖情況，通過RT-PCR檢測脈沖電磁場干預后雪旺細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA水平的表達，ELISA檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌情況。
　　結(jié)果：雪旺細胞在0.5、1.0、2.0 mT；50 Hz的脈沖電磁場干預下，無明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，當磁場強度增加至5.0 mT和10.0 mT時，細胞出現(xiàn)明顯凋亡；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)當磁場強度低于2.0 mT

7、時，雪旺細胞的形態(tài)良好，細胞延展成典型的雙極性形態(tài)，然而當磁場強度繼續(xù)升高至5.0 mT時，雪旺細胞表面出現(xiàn)空泡，細胞呈圓形且延展性變差，失去了雪旺細胞原有的形態(tài)特征。繼續(xù)將磁場強度增加到10.0 mT時，可以觀察到雪旺細胞的細胞膜已碎裂，細胞形態(tài)完全破壞，雪旺細胞徹底凋亡。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，在磁場下作用4小時雪旺細胞的活性達到最佳，當刺激時間繼續(xù)延長時，其活性并沒有發(fā)生明顯的變化。
　　雪旺細胞在脈沖電磁場（2.0 mT；

8、50Hz）干預后12小時和24小時，EdU結(jié)果顯示雪旺細胞明顯增殖，其合成和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF、VEGF的能力也有顯著提高。
　　結(jié)論：2.0 mT；50 Hz為最佳磁場參數(shù)，4小時為合理干預時間；該參數(shù)的脈沖電磁場可有效激活雪旺細胞，促進雪旺細胞的增殖，并促進其合成和分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子。
　　第二部分膠原-殼聚糖神經(jīng)導管的構(gòu)建及相關(guān)性能參數(shù)測試
　　目的：構(gòu)建具有良好的生物相容性、可降解性的膠原-殼

9、聚糖神經(jīng)導管，并進行相關(guān)性能參數(shù)測試。
　　方法：將膠原與殼聚糖以4:1的比例在冰醋酸中混合，通過梯度冷淋及冷凍干燥技術(shù)制備膠原-殼聚糖神經(jīng)導管，掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，并對其孔隙率、體外降解率、吸水膨脹率、抗拉強度進行相關(guān)測定。
　　結(jié)果：掃描電鏡下觀察神經(jīng)導管的橫截面為蜂窩狀多孔立體結(jié)構(gòu)，微孔間彼此連通交錯，從而有利于營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的運輸和交換。該導管具備良好的生物相容性、降解性、吸水膨脹性，以及抗拉強度等特點，為再

10、生的神經(jīng)纖維提供了良好的微環(huán)境，同時其中空樣的結(jié)構(gòu)有利于種子細胞的移植。
　　結(jié)論：膠原-殼聚糖神經(jīng)導管具有良好的微觀結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，是一種理想的組織工程神經(jīng)。
　　第三部分雪旺細胞復合神經(jīng)導管在脈沖電磁場的作用下修復坐骨神經(jīng)缺損的有效性研究
　　目的：探究雪旺細胞作為種子細胞與神經(jīng)導管相復合，在脈沖電磁場的刺激下，修復周圍神經(jīng)缺損的有效性。
　　方法：將雪旺細胞與膠原-殼聚糖導管相復合，用于修復大鼠12mm坐骨

11、神經(jīng)缺損，在術(shù)后12周同時輔以脈沖電磁場刺激（2.0 mT；50Hz），以實現(xiàn)對移植雪旺細胞的實時激活，分5組（1自體神經(jīng)移植組；2 Scaffolds組；3 Scaffolds+PMF組；4 Scaffolds+Scs組；5 Scaffolds+Scs+PMF組），對照比較其神經(jīng)修復效果的有效性。通過對再生神經(jīng)形態(tài)學（透射電鏡）的觀察和功能學（熒光金逆行示蹤；坐骨神經(jīng)指數(shù)和神經(jīng)電生理檢測）的分析以及靶肌肉的染色來評價其修復效果，并用

12、RT-PCR檢測再生神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，初步探究其再生機制。
　　結(jié)果：術(shù)后12周，電磁場作用下的雪旺細胞與膠原殼聚糖導管復合組可觀察到更多均勻分布的軸突，再生神經(jīng)纖維的數(shù)量和直徑明顯高于其他各組，并最接近自體神經(jīng)組。該組靶肌肉 HE染色顯示腓腸肌萎縮情況得到明顯緩解，脊髓前角運動神經(jīng)元和DRG感覺神經(jīng)元的數(shù)目顯著高于其他各組，坐骨神經(jīng)指數(shù)的逆轉(zhuǎn)速度高于其他幾組，神經(jīng)傳導速度、潛伏期和波幅也顯著好于其他幾組，并與自體神經(jīng)組無差異，