不同復(fù)蘇方案對繼發(fā)性腹腔高壓癥腸道損害的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　正常人的腹腔內(nèi)壓力(Intra-Abdominal Pressure，IAP)為0-5mmHg，當(dāng)IAP達(dá)到或者超過12mmHg時，定義為腹腔高壓癥(Intra-Abdominal Hypertension，IAH)。繼發(fā)性IAH是指由非起源于盆腹腔的病變所導(dǎo)致的IAP的升高，通常見于創(chuàng)傷、燒傷、膿毒癥、休克等需要大量補(bǔ)液的患者。繼發(fā)性IAH發(fā)生的病理生理過程主要表現(xiàn)為缺血再灌注損傷，在此過程中大量炎癥因子釋放、腸道通

2、透性增高、液體滲漏、腸管缺血水腫并最終導(dǎo)致繼發(fā)性IAH。繼發(fā)性IAH病情危重，死亡率高。因此，如何在對患者實施復(fù)蘇時降低繼發(fā)性IAH的發(fā)生是防治的重點。
　　褪黑素(Melatonin，MT)是由松果體合成并分泌的一種激素，在體內(nèi)具有強(qiáng)大的抗氧化的作用，可通過清除自由基、增強(qiáng)抗氧化酶活性等作用來對抗氧化應(yīng)激損傷。近年來，MT對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用也受到人們的關(guān)注，且外源性MT被證實可通過抑制炎癥反應(yīng)來發(fā)揮其臟器保護(hù)作用。因此，能否通

3、過在復(fù)蘇時使用外源性MT來抑制炎癥反應(yīng)、降低腸道的缺血再灌注損傷而減少腸道損害、降低繼發(fā)性IAH的發(fā)生？
　　本課題通過對SD大鼠實施失血性休克后過量液體復(fù)蘇來構(gòu)建繼發(fā)性IAH的大鼠模型，并在此模型的基礎(chǔ)上對比使用MT、7.5％高滲鹽溶液(Hypertonic Saline，HS)和羥乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch，HES)聯(lián)合LR來實施復(fù)蘇的方案對繼發(fā)性IAH的治療、預(yù)防作用的優(yōu)劣，明確各類復(fù)蘇方案對腸屏障功能

4、的保護(hù)效能。最后通過篩選分析信號通路研究，明確這些復(fù)蘇方案發(fā)揮保護(hù)作用所調(diào)控的信號通路的具體情況。
　　方法:
　　1.繼發(fā)性IAH大鼠模型的建立及其發(fā)生機(jī)制
　　通過對SD大鼠制作門靜脈恒定縮窄、股動脈放血導(dǎo)致失血性休克、腹部放置束縛裝置后，再使用乳酸林格氏液(Lactated Ringer's Solution，LR)(30ml/h×6h)進(jìn)行復(fù)蘇，能成功構(gòu)建SD大鼠的繼發(fā)性IAH模型，并通過酶聯(lián)免疫吸附實驗，高效

5、液相色譜檢測，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，免疫熒光組織化學(xué)染色和電鏡等方法來論證在構(gòu)建繼發(fā)性IAH過程中腸道通透性及緊密連接蛋白的變化情況。
　　2.不同復(fù)蘇方案對繼發(fā)性IAH復(fù)蘇效果的對比研究
　　在先前構(gòu)建的繼發(fā)性IAH的大鼠模型的基礎(chǔ)上，通過在復(fù)蘇開始階段使用MT、HS、HES對實驗動物進(jìn)行治療，然后再使用LR進(jìn)行液體復(fù)蘇，我們通過酶聯(lián)免疫吸附實驗，高效液相色譜檢測，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，免疫熒光組織化學(xué)染色和電鏡等方法對比觀察

6、這些方案在預(yù)防繼發(fā)性IAH中對腸道通透性、緊密連接的保護(hù)效果。
　　3.MT對繼發(fā)性IAH腸道損害保護(hù)作用及其機(jī)制研究
　　為進(jìn)一步探明褪黑素保護(hù)效果的潛在機(jī)制，我們采用免疫印跡實驗來分別檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（Signal Transducers and Activators of Transcription，STAT）信號通路和核因子κB(Nuclear Factor-κB，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mito

7、gen-ActivatedProtein Kinase，MAPK)信號通路，這三個信號通路的變化情況。同時，我們還通過在復(fù)蘇開始階段使用p38 MAPK的阻滯劑(SB203580)來觀察腸道損害的情況，明確MT是否通過影響p38 MAPK來發(fā)揮其對腸道的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立繼發(fā)性IAH的大鼠模型立
　　通過對SD大鼠采用恒定的門靜脈縮窄，腹部使用束縛帶，失血性休克2h后實施LR復(fù)蘇6h，復(fù)蘇結(jié)束后的

8、IVCP為(20.99±3.50) mmHg，均達(dá)到繼發(fā)性IAH的診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時在繼發(fā)性IAH的發(fā)生過程中，腸道炎癥反應(yīng)、氧化損傷加劇，通透性增高，緊密連接被破壞，緊密連接蛋白表達(dá)下降。
　　2.MT對繼發(fā)性IAH腸道損害的保護(hù)作用顯著
　　通過通過對比使用MT+LR、HS+LR和HES+LR進(jìn)行復(fù)蘇，我們發(fā)現(xiàn)，這些方案與單獨應(yīng)用LR相比均能夠降低繼發(fā)性IAH的發(fā)生率，同時還能降低腸道通透性、保護(hù)腸道上皮細(xì)胞間的緊密連接、抑

9、制炎癥反應(yīng)和氧化損傷。而在這三類方案中，MT+LR的效果則更為顯著，在復(fù)蘇結(jié)束時無一動物達(dá)到繼發(fā)性IAH的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.MT發(fā)揮繼發(fā)性IAH腸道損害后的保護(hù)作用的機(jī)制研究
　　本部分實驗通過檢測并對比MAPKs，STATs和NF-κB這三類信號通路，發(fā)現(xiàn)STAT-1、STAT-3信號通路，ERK1/2、JNK信號通路雖然有改變，但是不具有統(tǒng)計學(xué)意義。NF-κBp65和p38 MAPK信號通路的變化顯著，但是p38 MA

10、PK信號通路的變化趨勢更加明顯，揭示了MT可能通過調(diào)控p38 MAPK信號通路來發(fā)揮其保護(hù)作用。通過應(yīng)用p38 MAPK信號通路的阻滯劑SB203580進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MT對繼發(fā)性IAH的保護(hù)效應(yīng)可能依賴于抑制p38 MAPK信號通路來實現(xiàn)。
　　結(jié)論:
　　1.通過制作門靜脈恒定縮窄、腹部放置束縛裝置后，股動脈放血導(dǎo)致失血性休克(40mmHg×2h)，再使用LR進(jìn)行復(fù)蘇，能成功構(gòu)建大鼠的繼發(fā)性IAH模型。同時還證實在繼發(fā)性IA

11、H過程中，缺血再灌注損傷所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激并由此導(dǎo)致的腸屏障緊密連接的破壞、腸道通透性增高為基本的病理生理變化。
　　2.與單獨應(yīng)用LR復(fù)蘇相比，在復(fù)蘇階段使用MT+LR、HS+LR和HES+LR進(jìn)行復(fù)蘇，可以抑制腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，降低其氧化損傷，從而降低腸道通透性，減輕腸道水腫，降低繼發(fā)性IAH的發(fā)生，而其中MT的保護(hù)效果則更為顯著。
　　3.褪黑素可能通過阻滯p38 MAPK信號通路來發(fā)揮對繼發(fā)性IAH過程中