下頜骨骨折愈合中降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)一氧化氮合酶調(diào)控作用的研究.pdf

1、骨折愈合過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生理修復(fù)過(guò)程，感覺(jué)神經(jīng)在骨折初始通過(guò)向神經(jīng)中樞傳遞疼痛刺激參與了這一過(guò)程，最新研究證實(shí)在感覺(jué)神經(jīng)術(shù)梢，骨痂組織中的神經(jīng)肽類物質(zhì)參與了骨折的修復(fù)重建。降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitoningene-relatedpeptide，CGRP)是其中分布最為廣泛的一種神經(jīng)肽，主要分布在代謝活躍的骨組織結(jié)構(gòu)中，通過(guò)調(diào)節(jié)骨細(xì)胞發(fā)育、分化及活性，從而調(diào)節(jié)骨折愈合過(guò)程，其作用機(jī)制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮(Nitricoxi

2、de，NO)作為一種信號(hào)傳導(dǎo)分子在促進(jìn)骨折愈合初期的血管生成，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性等修復(fù)過(guò)程中都具有重要意義。一氧化氮合成酶(Nitricoxidesynthase，NOS)的內(nèi)皮型NOS(endothelialNOS，eNOS)和誘導(dǎo)型NOS(inducibleNOS，iNOS)兩個(gè)亞型在骨折整個(gè)過(guò)程中均有表達(dá)，發(fā)揮不同的生理作用，而神經(jīng)元型NOS(neuronalNOS，nNOS)亞型在骨折愈合過(guò)程中是否表達(dá)目前在學(xué)術(shù)上尚存爭(zhēng)

3、論。eNOS所合成的低濃度的NO可以促進(jìn)成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)，的增殖及其骨基質(zhì)分泌功能，還可以促進(jìn)破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)前體向OC轉(zhuǎn)換，提高OC的細(xì)胞活性，從而正調(diào)控骨折愈合。由細(xì)胞因子誘導(dǎo)iNOS產(chǎn)生的較高濃度NO對(duì)細(xì)胞卻有明顯的細(xì)胞毒性作用，高濃度的NO可降低OB活性、抑制其DNA合成、細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素產(chǎn)生，對(duì)骨折愈合產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。 在骨折愈合過(guò)程中，CGRP是否

4、通過(guò)對(duì)NO的調(diào)控行使了促進(jìn)骨折愈合這一調(diào)控機(jī)制?本實(shí)驗(yàn)旨在建立失神經(jīng)下頜骨骨折模型，改變骨痂中的CGRP表達(dá)和分布，從而研究骨痂中CGRP的改變對(duì)NOS的蛋白表達(dá)、酶活性所產(chǎn)生的影響；體外實(shí)驗(yàn)加入外源性CGRP培養(yǎng)成骨細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO濃度和細(xì)胞NOS的表達(dá)和活性，研究CGRP對(duì)成骨細(xì)胞NO生成的調(diào)控作用。 方法： 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將48只實(shí)驗(yàn)用成年中國(guó)大白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(左側(cè)IAN橫斷+左側(cè)下頜骨骨折組、

5、24只)及對(duì)照組(左側(cè)IAN暴露+單純左下頜骨骨折組、24只)。通過(guò)改良以往失神經(jīng)及下頜骨骨折模型的方法，建立更加穩(wěn)定、合理的兔失下齒槽神經(jīng)支配下頜骨骨折愈合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。兩組動(dòng)物分別于術(shù)后4、7、14、28天各處死6只。獲取骨折部位骨痂，液氮冷凍0.5g新鮮骨痂，NOS分型試劑盒檢測(cè)iNOS和eNOS活性，免疫印染法(Westernblot)檢測(cè)iNOS和eNOS蛋白表達(dá)；其余部份骨痂組織脫鈣固定后，免疫組織化學(xué)方法對(duì)兩組動(dòng)物骨痂組

6、織中CGRP、eNOS及iNOS的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析骨折愈合速度、方式和骨痂質(zhì)量。 細(xì)胞培養(yǎng)：為進(jìn)一步觀察CGRP對(duì)eNOS及iNOS表達(dá)和酶活性的影響，培養(yǎng)了新生兔顱骨成骨細(xì)胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色鑒定后，分別向培養(yǎng)液中加入不同濃度的外源性人降鈣素基因相關(guān)肽(hCGRP)，用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液配制成10-10、10-9、10-8和10-7mmol/L四個(gè)濃

7、度梯度組。設(shè)定含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液所培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組，在細(xì)胞培養(yǎng)的0.5h、1h、4h、12h和24h時(shí)間點(diǎn)，分別使用NO試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO濃度，Westernblot檢測(cè)細(xì)胞中iNOS和eNOS表達(dá)；NOS分型試劑盒檢測(cè)細(xì)胞iNOS和eNOS活性；MTT法和茜素紅染色法分別檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖能力和礦化能力。 結(jié)果： 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果： (1)骨痂組織學(xué)觀察：對(duì)照組骨痂組織中新生骨小梁粗大致密、

8、排列規(guī)則，且生長(zhǎng)速度較快；實(shí)驗(yàn)組骨小梁排列稀疏而不規(guī)則，骨痂結(jié)構(gòu)存在缺陷，類骨質(zhì)及骨吸收空腔較多。 (2)CGRP免疫組化染色：對(duì)照組骨折后7天骨痂中即可見(jiàn)CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維，沿血管分布，14天在編織骨邊緣有大量的CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維，CGRP的表達(dá)達(dá)到峰值，28天仍較多；實(shí)驗(yàn)組骨痂中的CGRP呈弱陽(yáng)性表達(dá)，圖像光密度半定量分析結(jié)果顯示在4-14d兩組間CGRP表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05或p＜0.01)。 (3)

9、eNOS和iNOS免疫組化染色：eNOS于骨痂血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和胞膜中表達(dá)陽(yáng)性，其中4d、7d時(shí)段實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間有顯著差異(p＜0.05或p＜0.01)；iNOS于骨痂成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的胞漿和胞膜中表達(dá)陽(yáng)性，各時(shí)段兩組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (4)新鮮骨痂中eNOS和iNOS表達(dá)：Westernblot分析顯示骨痂中eNOS在術(shù)后4d表達(dá)量最高，隨后逐漸降低，14d后保持基本恒定；在4d時(shí)段實(shí)驗(yàn)組條帶蛋白表達(dá)

10、量明顯低于對(duì)照組(p＜0.01)。iNOS的表達(dá)量在骨折愈合過(guò)程的4d-28d是處于增高趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (5)新鮮骨痂中eNOS和iNOS活性檢測(cè)：NOS活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在4d、7d時(shí)段eNOS的酶活性實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組(p＜0.01)，而iNOS的酶活性實(shí)驗(yàn)組在14d、28d顯著低于對(duì)照組，其余時(shí)段無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果： (1)新生兔顱骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)后，培

11、養(yǎng)細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多呈三角形、多角形。ALP染色顯示成骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)灰黑色顆粒和塊狀沉淀，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為成骨細(xì)胞。 (2)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)組0.5-4h時(shí)段，培養(yǎng)液NO濃度明顯高于對(duì)照組(p＜0.05或p＜0.01)，12h后無(wú)明顯差別。 (3)成骨細(xì)胞eNOS和iNOS表達(dá)檢測(cè)：Westernblot檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組eNOS條帶灰度值高于對(duì)照組。定量分析結(jié)果表明與對(duì)照組灰度值比

12、較，12h實(shí)驗(yàn)組不同濃度CGRP作用下的eNOS蛋白表達(dá)均顯著升高(p＜0.05或p＜0.01)。而iNOS蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (4)成骨細(xì)胞eNOS和iNOS活性檢測(cè)：在早期0.5-4h時(shí)段不同濃度的CGRP實(shí)驗(yàn)組的eNOS活性明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)，24h后無(wú)明顯差別。iNOS各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (5)成骨細(xì)胞增殖和礦化的檢測(cè)：在CGRP作用24h，MTT法檢測(cè)

13、實(shí)驗(yàn)組細(xì)增殖能力顯著高于對(duì)照組(p＜0.05或p＜0.01)；在CGRP作用14d后，茜素紅染色檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)明顯多于對(duì)照組(p＜0.01)。 結(jié)論: (1)本實(shí)驗(yàn)所采取的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型有效地改變了骨痂部位CGRP表達(dá)和分布，失神經(jīng)支配使骨折部位CGRP表達(dá)顯著減少，形成的骨痂有明顯的結(jié)構(gòu)缺陷，同時(shí)骨折愈合速度減慢。 (2)骨折愈合過(guò)程中，CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布與骨修復(fù)能力密切相關(guān)，表明CGRP在骨折

14、愈合過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 (3)在骨痂愈合過(guò)程中eNOS和iNOS的表達(dá)和活性具有明顯的時(shí)效性，在骨折愈合的不同階段具有重要意義，直接調(diào)控骨折愈合過(guò)程。 (4)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均表明，CGRP表達(dá)與eNOS的表達(dá)和活性呈正相關(guān)，而對(duì)iNOS調(diào)控有待于進(jìn)一步探討。CGRP能夠上調(diào)細(xì)胞合成NO的能力，因此，NO/NOS系統(tǒng)可能是CGRP參與骨折愈合調(diào)節(jié)的一條信號(hào)途徑。 (5)CGRP對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和礦化能力具有促