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文檔簡介
1、本研究利用RACE技術(shù),從鹽生植物——西伯利亞蓼中克隆了rd22基因(GenBank accession no.DQ836050)的cDNA序列,對該基因的生物信息學(xué)顯示,rd22 eDNA基因cDNA全長1302bp,其中開放讀碼框(ORF)為1218bp,編碼405個(gè)氨基酸組成的蛋白。該蛋白是一個(gè)堿性的分泌蛋白,預(yù)測分子量為43.0kD,理論等電點(diǎn)為.9.47。RD22蛋白序列N端前21個(gè)氨基酸具有較強(qiáng)的疏水性,被預(yù)測為信號(hào)肽結(jié)構(gòu),
2、對d22基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源分析,發(fā)現(xiàn)序列的C端存在一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。d22基因編碼的蛋白屬于BURP蛋白家族,其具有共同的結(jié)構(gòu)特征:(1)N端疏水區(qū); (2)短保守片段;(3)包含重復(fù)序列區(qū)域;(4)保守的BURP結(jié)構(gòu)域。 利用Northern雜交技術(shù),對所克隆的rd22基因在鹽脅迫下西伯利亞蓼各組織中的表達(dá)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,西伯利亞蓼rd22基因在不同組織中表達(dá)模式具有時(shí)空多樣性,在地下莖中不表達(dá),在
3、莖中大量表達(dá)但不受鹽誘導(dǎo),在葉中卻受鹽誘導(dǎo)。 rd22基因編碼的氨基酸序列中含有一個(gè)保守的BURP結(jié)構(gòu)域,但其功能也是未知的。為驗(yàn)證rd22基因和編碼BURP結(jié)構(gòu)域的序列是否具有耐鹽功能,將二者測序驗(yàn)證后連入植物表達(dá)載體pROKII,構(gòu)建了兩個(gè)重組質(zhì)粒pROK-rd22、pROK-burp。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,經(jīng)卡那抗性篩選,共獲得了84株抗性植株。選擇部分轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行PCR檢測和Northern雜交分析,證明了外源基因已
4、整合到煙草基因組中,除了一個(gè)株系外,都得到了轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。分別選擇4個(gè)轉(zhuǎn)rd22煙草株系和4個(gè)轉(zhuǎn)burp煙草株系進(jìn)行耐鹽堿試驗(yàn),結(jié)果表明,200retool·L<'-1>NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因株系的根生長狀況要好于非轉(zhuǎn)基因株系;5retool·L<'-1>NaHCO<,3>脅迫下,野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草生長狀況差異不顯著。因此,轉(zhuǎn)基因煙草對中性鹽的耐受力較好,強(qiáng)于堿性鹽。對各株系進(jìn)行了MDA含量及SOD、POD活性測定,200mmol·
5、L<'-1>NaCI脅迫下轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量低于非轉(zhuǎn)基因株系,POD活性高于非轉(zhuǎn)基因株系,但SOD活性無顯著差異;5mmol·L<'-1>NaHCO<,3>脅迫下,各轉(zhuǎn)化株系的三個(gè)生理指標(biāo)與對照株系比未見顯著差異。說明兩個(gè)外源基因的轉(zhuǎn)化使煙草的耐鹽能力稍有提高,但增幅不顯著;對耐堿能力沒有太大增加。因此,西伯利亞蓼的rd22基因及編碼其BURP結(jié)構(gòu)域的序列對煙草的轉(zhuǎn)化沒能提高轉(zhuǎn)基因煙草組培苗對鹽堿的抗性。西伯利亞蓼的rd22基因及編
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