包含有未生長卵子和成熟卵子基因組的二倍體小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞的分離和肌肉損傷修復(fù)模型的建立.pdf

1、在缺少雄性配子基因組的情況直接激活成熟卵子能夠形成孤雌囊胚，從這個(gè)孤雌囊胚中可以分離得到孤雌胚胎干細(xì)胞。孤雌胚胎干細(xì)胞的使用避開了倫理問題，可以為再生醫(yī)學(xué)提供種子細(xì)胞來源，在細(xì)胞移植、組織和器官重建方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但是與受精胚來源的胚胎干細(xì)胞相比，孤雌胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能是非常有限的。造成這一結(jié)果的原因之一可能是父源性基因組的缺失。以往的報(bào)道證實(shí)未生長卵子(新生小鼠卵子)在多個(gè)印記基因表達(dá)模式上具有精子基因組的特點(diǎn)。本研究首次應(yīng)

2、用基于“zona-free”的生發(fā)泡移植技術(shù)構(gòu)建了包含有未生長卵子和成熟卵子基因組的二倍體孤雌囊胚(NF-pBlastocysts)；首次建立了三株包含有未生長卵子和成熟卵子基因組的孤雌胚胎干細(xì)胞系(NF-pES cells)。為了證明NF-pES細(xì)胞具有臨床治療價(jià)值，我們制造了小鼠肌肉損傷修復(fù)模型。結(jié)果顯示，NF-pES細(xì)胞能夠分化形成骨骼肌纖維，參與損傷肌肉的修復(fù)。 作為一個(gè)新型的孤雌胚胎干細(xì)胞，NF-pES細(xì)胞不僅在再生

3、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景而且也提供了一個(gè)研究基因印記和器官發(fā)育相互關(guān)系的體外研究工具。NF-pES細(xì)胞的分離成功也為建立人類孤雌胚胎干細(xì)胞系提供了一個(gè)新的思路。 1．胚胎干細(xì)胞研究平臺(tái)的建立-----建立在絲裂霉素處理的胎兒成纖維細(xì)胞上的胚胎干細(xì)胞的分離與鑒定由于進(jìn)口的絲裂霉素C屬國家管制藥品，難以購到而且市場報(bào)價(jià)較貴，所以我們選用國內(nèi)知名生產(chǎn)商浙江海正藥業(yè)生產(chǎn)的國藥準(zhǔn)字H33020786的絲裂霉素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)絲裂霉素

4、濃度為20μg/ml作用4h或30μg/ml作用2h、4h時(shí)，均可有效抑制細(xì)胞的分裂而不影響細(xì)胞活力。小鼠胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)濃度為30μg/ml的絲裂霉素作用2h后制備飼養(yǎng)層，將7枚體內(nèi)受精囊胚種植在該飼養(yǎng)層上，從中共獲得5個(gè)胚胎干細(xì)胞株。經(jīng)鑒定，所有胚胎干細(xì)胞株都表達(dá)堿性磷酸酶活性，Oct-4和SSEA-1陽性，能夠形成具有三個(gè)胚層分化能力的畸胎瘤，其中一個(gè)細(xì)胞株具有生殖系嵌合能力。因此，浙江海正藥業(yè)生產(chǎn)的絲裂霉素不僅對小鼠胚胎成纖維細(xì)

5、胞的生長具有明顯的抑制作用，而且支持具有生殖系嵌合能力的ES細(xì)胞的分離。國產(chǎn)絲裂霉素價(jià)格低廉，大大降低了實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)本研究也為國產(chǎn)藥品在ES細(xì)胞研究中的應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。 2．包含有未生長卵子(non-growing oocytes)和成熟卵子(fully grown oocytes)基因組的二倍體孤雌胚胎的構(gòu)建和孤雌胚胎干細(xì)胞(NF-pES cells)系的建立在應(yīng)用常規(guī)生發(fā)泡移植技術(shù)構(gòu)建重構(gòu)二倍體孤雌胚胎過程中，GV

6、期卵子的卵周隙是影響去核效率的一個(gè)重要的限制因素。為了解決這一問題，我們發(fā)明了一套基于“zona-free”的生發(fā)泡移植技術(shù)程序。具體做法是在去核操作前將GV期卵子的透明帶去除，將所有卵子都放在濃度為5或25μg/ml CCB的操作液內(nèi)，僅使用一個(gè)顯微操作臂進(jìn)行去核，去核率為83.76％。去核GV期卵子經(jīng)PHA-P與未生長卵子進(jìn)行粘合，在融合電壓為180V、脈沖寬度為20μs和一次電脈沖下融合效率為62.80％。融合的重構(gòu)卵子在TYH中

7、進(jìn)行成熟培養(yǎng)，成熟率為70.89％?；凇皕ona-free”的生發(fā)泡移植技術(shù)不僅無需依據(jù)卵周隙的大小取舍卵子，減少了切口針對卵子的破壞和提高了去核效率，而且降低了操作難度，易于為初學(xué)者所掌握。 已有研究證實(shí)未生長卵子的基因組表達(dá)某些父源性表達(dá)的基因而某些母源性表達(dá)的基因則被抑制。因此未生長卵子基因組在一定程度上充當(dāng)了精子基因組的作用。本研究應(yīng)用基于“zona-free”的生發(fā)泡移植技術(shù)，使用383枚GV期卵子共獲得64枚來自

8、未生長卵子的MⅡ期卵子。將這些MⅡ期卵子的核區(qū)移植到體內(nèi)成熟的昆明小鼠MⅡ期卵子的透明帶下，共重構(gòu)成功56枚。經(jīng)電融合處理，有51枚發(fā)生融合。經(jīng)SrCl<,2>激活后，獲得22枚形成兩個(gè)原核和排出兩個(gè)極體的重構(gòu)胚。將這22枚重構(gòu)胚繼續(xù)體外發(fā)育共得到13枚囊胚。從這13枚囊胚共分離得到3株NF-pES細(xì)胞系。所有NF-pES細(xì)胞株均表達(dá)堿性磷酸酶活性，SSEA-1和Oct-4陽性。選取其中兩株NF-pES細(xì)胞系制備嵌合體。嵌合體鼠的心臟、

9、脾、腎和骨髓的流式細(xì)胞檢驗(yàn)結(jié)果顯示，一株NF-pES細(xì)胞(NF-pES-1)在以上四個(gè)臟器的嵌合率分別是15.07％、41.02％、3.55％和11.53％。另外一株NF-pES細(xì)胞系(NF-pES-2)是83.36％、68.74％、29.70％和50.44％。對照組受精胚來源的ES細(xì)胞在其嵌合鼠的心臟、脾、腎和骨髓的嵌合率分別是77.96％、84.06％、42.49％和52.02％。方差分析顯示NF-pES-2在心臟、脾和骨髓上的嵌合

10、率與受精胚來源的ES細(xì)胞無顯著差異。這一結(jié)果表明包含有未生長卵子和成熟卵子基因組的孤雌胚胎干細(xì)胞至少在心臟、脾和骨髓方向發(fā)育上具有和受精胚來源的胚胎干細(xì)胞相當(dāng)?shù)陌l(fā)育潛能，這為孤雌胚胎干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的證據(jù)。 3．肌肉損傷修復(fù)模型的建立NF-pES細(xì)胞來源的畸胎瘤和嵌合體組織中存在大量骨骼肌纖維的事實(shí)表明NF-pES細(xì)胞具有分化成為骨骼肌纖維的潛能。臨床上有一些退行性疾病與肌肉損傷或功能喪失有關(guān)如杜氏肌營

11、養(yǎng)不良癥等。目前尚無特效藥應(yīng)用于此類疾病的治療。近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植是一個(gè)非常有效的辦法。為了證明NF-pES細(xì)胞具有作為移植供體細(xì)胞治療該類疾病的臨床應(yīng)用價(jià)值，我們使用心臟毒素處理結(jié)合射線照射小鼠的脛骨前肌制造了肌肉損傷模型。首先NF-pES細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成為混合的前體細(xì)胞，然后將這些前體細(xì)胞移植到小鼠脛骨前肌受損部位。一個(gè)月后取材進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果顯示NF-pES細(xì)胞來源的前體細(xì)胞能夠嵌合到骨骼肌組織，并且形成部分骨骼肌纖維。