熒光光譜和吸收光譜法研究藍膜和紫膜中細菌視紫紅質(zhì).pdf

1、紫膜在嗜鹽菌(Halobacterium halobium)原生質(zhì)膜上以碎片形式存在(每個碎片含10萬個茵紫質(zhì)分子)。細菌視紫紅質(zhì)(bacteriorhodopsin，BR)是紫膜中惟一的蛋白質(zhì)成分，由248個氨基酸和1個視黃醛分子組成，并通過7個α螺旋結(jié)構(gòu)跨膜整合在細胞膜中，分子量26KD。BR中含有8個色氨酸(T印)和11個酪氨酸(Tyr)，具有光驅(qū)動質(zhì)子泵、光循環(huán)和光電響應(yīng)功能。紫膜在pH≈2下或者去除紫膜表面的二價金屬離子(Ca

2、<'2+>和Mg<'2+>)后變成藍膜，不能進行光循環(huán)，也沒有質(zhì)子泵功能。人們對紫膜中BR分子的結(jié)構(gòu)、光循環(huán)和光致變色效應(yīng)已經(jīng)有了較深入的認識，開始探索把這種生物分子材料應(yīng)用于光電探測、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、光學(xué)信息存儲與處理、生物芯片等方面。到目前為止，采用熒光光譜和吸收光譜方法對藍膜和紫膜中BR蛋白質(zhì)進行研究的報道不多。本試驗利用熒光光譜和吸收光譜等方法，比較在室溫下藍膜和紫膜中BR蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的差異以及溫度對構(gòu)象改變的影響。試驗結(jié)果如下

3、： 1．吸收光譜研究發(fā)現(xiàn)，在室溫下，藍膜中視黃醛的特征峰是605nm，紫膜光適應(yīng)狀態(tài)中視黃醛的特征峰是570nm，紫膜暗適應(yīng)狀態(tài)中視黃醛的特征峰是560nm，藍膜視黃醛區(qū)域峰形不同于紫膜的。四階微分紫外吸收光譜研究發(fā)現(xiàn)，藍膜BR蛋白質(zhì)的特征峰相對于紫膜的稍有藍移。更有意思的是，吸收光譜研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，藍膜中視黃醛的605nm特征峰光吸收降低，在65-75℃的狹窄溫度范圍內(nèi)，此特征峰光吸收隨著溫度急劇降低，幾近消失

4、。與此同時，在380 nm處卻出現(xiàn)一吸收峰，表明藍膜中視黃醛的局部構(gòu)象與溫度有關(guān)，這一現(xiàn)象以前未曾有過報道。并且藍膜BR蛋白質(zhì)受溫度影響的過程是不可逆的。與此不同的是，隨著溫度的升高，在紫膜中只能觀察到視黃醛的570nm特征峰光吸收的降低。 2. 內(nèi)源熒光研究發(fā)現(xiàn)，在室溫下，藍膜和紫膜中BR蛋白質(zhì)的最大激發(fā)波長都在280 nm。藍膜和紫膜BR蛋白質(zhì)中色氨酸熒光的最大發(fā)射波長都在340nm左右，但在藍膜中BR蛋白質(zhì)的熒光效率比紫膜

5、的高出1.4倍。藍膜和紫膜BR蛋白質(zhì)在280nm激發(fā)下最大發(fā)射波長分別是331nm和326nm，內(nèi)源熒光是色氨酸和酪氨酸的共同貢獻，并且紫膜中酪氨酸對熒光的貢獻更大。熒光研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨著溫度上升，藍膜中BR蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強度減小，而紫膜中BR.蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強度明顯增強。研究還發(fā)現(xiàn)，隨著溫度上升，藍膜和紫膜中色氨酸的熒光最大發(fā)射波長僅有微小紅移，在100℃時，最大發(fā)射波長才紅移至346nm，表明BR蛋白質(zhì)只發(fā)生了部分去折疊，也表明藍

6、膜和紫膜中BR蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性相當高。 3.外源熒光探針bis-ANS的研究表明，藍膜中BR蛋白質(zhì)可結(jié)合bis-ANS，其解離平衡常數(shù)為12.21pmol/L，藍膜BR蛋白質(zhì)表面存在可結(jié)合bis-ANS的疏水性區(qū)域，而紫膜中BR蛋白質(zhì)則幾乎不能結(jié)合bis-ANS。表明藍膜和紫膜中BR蛋白質(zhì)表面疏水性不同。隨著溫度上升，藍膜中BR蛋白質(zhì)結(jié)合的bis-ANS熒光藍移，同時熒光強度明顯增強(尤其是60-75℃更明顯)。在25℃、65℃、

7、80℃、90℃時，藍膜中BR蛋白質(zhì)結(jié)合熒光探針bis-ANS的解離平衡常數(shù)K<,d>分別為12.21、5.22、6.42、7.09 μmol/L。在不同溫度下，藍膜BR蛋白質(zhì)與bis-ANS都只有一個結(jié)合位點。 4. 通過熒光光譜、吸收光譜和停流技術(shù)對酸化紫膜轉(zhuǎn)變成藍膜變化過程的跟蹤研究表明，視黃醛特征峰的遞變(570→605 nm)以及蛋白質(zhì)熒光最大發(fā)射波長的遞變(326→331nm)都是在狹窄的HCl濃度范圍(11.5-13

8、.3 mmol/L)內(nèi)同步進行的，該轉(zhuǎn)變過程在0-2s之內(nèi)極快完成。 5. 高壓力試驗結(jié)果顯示，當壓力增加至260MPa，藍膜和紫膜BR.蛋白質(zhì)的熒光光譜沒有發(fā)生變化。藍膜和紫膜BR蛋白質(zhì)溶液中加入鹽酸胍濃度達到8 mol/L也沒有變性，再采用260MPa的高壓力試驗其熒光光譜仍然沒有發(fā)生變化。表明藍膜和紫膜BR蛋白質(zhì)對高壓力和變性劑都有很好的耐受性。 我們從BR蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光、與外源熒光探針的結(jié)合、吸收光譜以及它們受溫