解除獨(dú)行菜種子低溫萌發(fā)停滯的溫度響應(yīng)蛋白篩選及表達(dá)分析.pdf

1、獨(dú)行菜(Lepidium apetalum Willd.)為十字花科獨(dú)行菜屬植物，分布十分廣泛。前期研究發(fā)現(xiàn)，生活在新疆北部的獨(dú)行菜在低溫下萌發(fā)到一定階段會(huì)出現(xiàn)停滯現(xiàn)象，而經(jīng)較高溫度短時(shí)間處理，種子即可在低溫下繼續(xù)萌發(fā)生長(zhǎng)。因此運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從解除低溫萌發(fā)停滯的獨(dú)行菜種子中篩選相關(guān)響應(yīng)蛋白，并分析各蛋白相應(yīng)基因在低溫萌發(fā)不同時(shí)期的表達(dá)情況，克隆解除低溫萌發(fā)停滯的關(guān)鍵基因，為闡明新疆北部獨(dú)行菜早春低溫萌發(fā)的調(diào)控機(jī)制和獨(dú)行菜廣泛分布的

2、區(qū)系特征提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.獨(dú)行菜種子蛋白雙向電泳體系的建立
　　比較了三種常用植物蛋白提取方法對(duì)獨(dú)行菜種子蛋白的提取效果，最終采用TCA/丙酮沉淀法進(jìn)行提??；優(yōu)化組合上樣方式，聚焦程序，分離膠濃度等蛋白分離條件，最終建立了一套適用于獨(dú)行菜種子蛋白質(zhì)的雙向電泳體系，得到2-DE圖譜重復(fù)性好，分辨率高。
　　2.低溫萌發(fā)停滯解除前后差異表達(dá)蛋白的圖譜分析
　　比較低溫萌發(fā)停滯解除前后的2-DE

3、圖譜，篩選得到37個(gè)差異蛋白點(diǎn)，對(duì)其中6個(gè)低溫萌發(fā)停滯解除后表達(dá)量顯著上調(diào)的蛋白點(diǎn)做LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定。根據(jù)鑒定結(jié)果，將這六個(gè)蛋白按功能分為三大類：第一類為分子伴侶，包括Cpn60，Hsp17.6I，Hsp70；第二類為過氧化物酶，包括Per12和Per28；第三類為細(xì)胞分裂控制蛋白即Cdc48E。
　　3.關(guān)鍵蛋白的相應(yīng)基因表達(dá)分析
　　以上述鑒定結(jié)果檢索獨(dú)行菜種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，得到關(guān)鍵蛋白相應(yīng)基因的部分核酸序列信息

4、。從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)Per12，Hsp17.6I和Cdc48E三種蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析，對(duì)它們相應(yīng)的基因PER12，HSP17.6和CDC48E在獨(dú)行菜種子低溫萌發(fā)停滯解除前后及在經(jīng)25℃處理不同時(shí)間低溫萌發(fā)停滯期的種子中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因的表達(dá)量在25℃處理萌發(fā)停滯期的種子30min后較未解除停滯前均顯著增加，且25℃處理45-55min內(nèi)，表達(dá)量隨25℃處理時(shí)間的增加而增加，處理60min后，表達(dá)趨于穩(wěn)定，不再顯著增長(zhǎng)。

5、>　　4.獨(dú)行菜種子CDC48E基因的克隆與序列分析
　　采用同源克隆技術(shù)，獲得了獨(dú)行菜種子CDC48E的保守區(qū)片段。該基因保守區(qū)cDNA含有1103bp，約編碼363個(gè)氨基酸。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)解除低溫萌發(fā)停滯的獨(dú)行菜種子的CDC48E基因的保守區(qū)核酸序列進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)， 結(jié)果表明：該核酸片段含有兩個(gè)AAA保守結(jié)構(gòu)域，分別位于163-567，166-576bp處；還含有一個(gè)CDC48結(jié)構(gòu)域，位于753-1007bp處