以甘油為底物產二羥丙酮（DHA）微生物的選育及甘油脫氫酶酶學性質的研究.pdf

1、二羥丙酮(DHA)是一種重要的化工原料，在精細化工、制藥、食品等方面具有廣泛的應用前景。本研究從自然界篩選出21株能夠以甘油為唯一碳源產二羥丙酮的菌株，經初步發(fā)酵測定發(fā)酵液中DHA含量，其中菌株6-8DHA產量最高達6.2g/L。對其進行常規(guī)生理生化鑒定實驗，并結合16SrDNA基因分析，比對結果表明，菌株6-8與Acinetobactersp.B8-22相似性最高，達99.7％，在細菌分類學上屬于假單胞菌目莫拉菌科不動桿菌屬，將其命名

2、為Acinetobactersp.6-8。在研究Acinetobactersp.6-8在LB培養(yǎng)基中的生長曲線的基礎上，考察了培養(yǎng)時間與培養(yǎng)溫度對Acinetobactersp.6-8發(fā)酵DHA的影響，最終確定37℃時發(fā)酵72h即可獲得較高的DHA產量。在搖瓶水平上，分別考察了碳源和氮源對Acinetobactersp.6-8發(fā)酵產DHA的影響，并對碳氮源綜合水平進行了正交實驗優(yōu)化，最終確定采用甘油10.0％、山梨醇2.0％、酵母膏0.

3、5％、玉米漿0.2％作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源濃度，以此條件發(fā)酵，DHA產量為7.21g/L，比未優(yōu)化時DHA產量提高了9.8％； 建立了簡單且準確測定二羥丙酮(DHA)的高效液相色譜(HPLC)方法，以AlltimaC18(5μm，250×4.6mm)為分離柱，5％甲醇水溶液(0.05％H3PO4調pH至3.0)為流動相，用紫外檢測器在203nm處檢測DHA。結果測得DHA標準樣品在203nm的保留時間為6.2min，并測得DHA

4、的線性范圍為0.1～10.0g/L，用HPLC法測得以甘油為底物發(fā)酵產DHA發(fā)酵液中DHA含量與顯色法測得的DHA含量一致。 以克雷伯氏菌基因組DNA為模板，擴增得到編碼甘油脫氫酶(GDH)基因dhaD，將其克隆到大腸桿菌表達載體pET-28a(+)上，在E.coliBL21(DE3)中誘導表達，利用表達載體pET-28a(+)上的6-His-Tag標記選用Ni2+柱純化具有表達活性的甘油脫氫酶(GDH)，純化后比酶活達到156

5、U/mg，純化倍數(shù)達4.6倍，回收率為67.4％。并初步研究了該酶的酶學性質：酶反應的最適pH為11.0，在pH7.0～12.0范圍內穩(wěn)定；酶反應的最適溫度為30℃，穩(wěn)定范圍為25℃～45℃；Mg2+、Cu2+、Zn2+、K+對酶促反應有一定的激活作用；酶動力學參數(shù)以甘油為底物的Km為0.54mmol/L，Vmax為0.49μmol/(mL·min)，說明了此酶對甘油的親和性較高。本實驗采用了生物全細胞轉化的方法，將重組大腸桿菌培養(yǎng)至對