雌激素通過激活雌激素受體β上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2促進非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移及機制研究.pdf

1、目的：非小細胞肺癌是目前致死率最高的惡性腫瘤之一。近年來，包括我們在內(nèi)的大量研究證實雌激素主要通過激活雌激素受體β（ERβ）促進非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，其中，已有研究在體外實驗中證實雌激素能顯著促進 NSCLC細胞的增殖和遷移，且顯著促進小鼠皮下移植瘤的進展，但雌激素是否能通過激活 ERβ進一步促進轉(zhuǎn)移及其機制則尚無報道?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）已被廣泛認為是促進惡性腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，且MMP1，MMP2和MMP9在非小細胞肺癌

2、組織內(nèi)高表達，但在NSCLC中MMPs與ERβ間的表達和作用有無關(guān)聯(lián)，若ERβ能促進NSCLC轉(zhuǎn)移，是否與MMPs相關(guān)也尚無報道。為明確雌激素在NSCLC轉(zhuǎn)移過程中的作用和與MMPs之間的關(guān)系，本研究擬通過NSCLC組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)體外和體內(nèi)實驗多層面探討雌激素是否促進 NSCLC轉(zhuǎn)移及其機制為抗雌激素靶向治療晚期非小細胞肺癌的潛在價值提供新的依據(jù)。
　　方法：首先通過免疫組化檢測222例人NSCLC組織芯片標本中ERβ和MMP1

3、、MMP2、MMP9的表達并分析其相關(guān)性；檢測30例配對轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)標本與NSCLC原發(fā)灶間 ERβ表達是否存在差異。在體外實驗中，通過雌激素相關(guān)藥物（雌二醇E2，ERα特異性激動劑PPT，ERβ特異性激動劑DPN和ER抑制劑Ful）的分別和聯(lián)合干預NSCLC細胞A549和H1793，檢測遷移和侵襲特性的改變以及ERβ和MMPs的蛋白表達變化；接著通過siRNA-ERβ沉默或搭載過表達ERβ質(zhì)粒載體的干預調(diào)控ERβ的表達，進一步觀察ERβ

4、對NSCLC細胞轉(zhuǎn)移效應的影響和機制，同時檢測ERβ、MMPs和下游信號通路蛋白p38MAPK、AKT表達情況。最后，利用Balb/c裸鼠建立 A549細胞體內(nèi)肺癌轉(zhuǎn)移模型并給與上述雌激素相關(guān)藥物干預，觀察NSCLC轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成情況和上述蛋白的表達，在體內(nèi)實驗中進一步驗證雌激素能否促進NSCLC轉(zhuǎn)移和其可能機制。
　　結(jié)果：人 NSCLC組織芯片-免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=5.666，p值=0.017）和分

5、化程度較低（χ2=4.427，p值=0.035）的NSCLC中 ERβ表達顯著增高且具有統(tǒng)計學意義；（2）NSCLC腫瘤組織中 ERβ高表達與MMP2蛋白高表達呈正相關(guān)性（p值＜0.001，sperman's rho=0.428）；（3）30例配對 NSCLC患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)灶中 ERβ表達程度顯著高于 NSCLC原發(fā)灶（t值=4.402,p值<0.001）。
　　體外實驗發(fā)現(xiàn)，（1）在雌激素刺激下，NSCLC細胞中ERβ和MMP2

6、蛋白表達水平明顯上調(diào)且呈現(xiàn)時間梯度和濃度梯度依賴性。（2）在不同雌激素相關(guān)藥物干預中，E2和DPN實驗組比對照組表現(xiàn)出遷移和侵襲效應的明顯增強，且ERβ與MMP2蛋白表達水平隨之上升；加入Ful后，E2所引起的侵襲性顯著受到抑制，同時ERβ與MMP2表達下降；PPT組不能引起NSCLC細胞遷移和侵襲效應或相關(guān)蛋白表達的明顯改變。（3）NSCLC細胞在受到E2和DPN干預后下游信號通路磷酸化蛋白p-p38MAPK和p-AKT蛋白表達明顯上

7、升，隨后加入Ful之后可明顯抑制其表達。（4）利用siRNA-ERβ特異性沉默了ERβ表達后NSCLC細胞的遷移和侵襲效應的下降，同時伴隨著MMP2，p-p38MAPK和p-AKT蛋白表達的抑制；而通過過表達質(zhì)粒上調(diào)ERβ表達時反之。
　　體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，在利用Balb/c裸鼠建立A549細胞肺癌轉(zhuǎn)移瘤模型中發(fā)現(xiàn)：相較于對照組，E2和DPN干預組出現(xiàn)了更高的肺濕重（p值＜0.01）、更高的肺結(jié)節(jié)數(shù)（p值=0.021<0.05）和更高

8、的轉(zhuǎn)移指數(shù)（p值＜0.001）；E2+Ful組的成瘤效應明顯受到抑制；PPT組沒有明顯改變；。將肺轉(zhuǎn)移瘤組織提取蛋白行WesternBlot檢測后發(fā)現(xiàn)E2和DPN干預組的ERβ、MMP2、p-p38MAPK和p-AKT蛋白表達上升，與體外實驗結(jié)果一致。
　　結(jié)論：從上述研究我們發(fā)現(xiàn)，雌激素能顯著促進非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移，其機制可能是：雌激素通過激活ERβ上調(diào)MMP2表達并激活ERK/MAPK和PI3K/AKT等重要下游信號通路，阻斷雌