納米級炭黑顆粒對16HBE細胞毒性作用及影響因素的研究.pdf

1、目的:炭黑（carbon black,CB）是一種超細碳粒子，是燃料不完全燃燒時產(chǎn)生的煙塵中的主要組成部分。炭黑納米顆粒（carbon black nanoparticles,CBNPs）是通過控制碳氫化合物的氣相裂解過程生產(chǎn)制造而成的純的炭黑粉末，隨著CBNPs的商業(yè)化及CB向大氣的排放量持續(xù)升高，CBNPs的暴露與人類健康風險的評估備受關注。有研究證明處于不同周期的細胞會對納米顆粒的攝取量存在差異，而細胞內(nèi)納米顆粒的含量與其所引起的

2、細胞毒性密切相關。目前CBNPs對細胞產(chǎn)生的毒性損害以及不同細胞周期對于細胞的CBNPs攝取量是否產(chǎn)生影響尚不清楚，因此探究CBNPs產(chǎn)生的細胞損傷作用及不同周期對細胞攝取CBNPs量的影響具有十分重要的意義。本研究通過研究不同細胞周期對人支氣管上皮細胞（16HBE）的CBNPs攝取量的影響為切入點，探究CBNPs對16HBE的細胞毒性效應及其影響因素。
　　方法：
　　1.納米炭黑顆粒表征觀察
　　通過掃描電子顯微鏡

3、和透射電子顯微鏡觀察納米炭黑的結構特征。采用粒徑分析儀分析納米炭黑的粒徑，BET比表面積測試法測量炭黑顆粒比表面積。
　　2.細胞培養(yǎng)和細胞模型建立
　　16HBE（中國典型培養(yǎng)物保藏中心）用含10％熱滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)基37℃，5%CO2飽和濕度下進行培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期的細胞，用CBNPs處理24小時，劑量分別為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL；以MEM（含0.04%Tween80）為陰性對照。<

4、br>　　3.MTT法檢測細胞存活率
　　分別使用陰性對照組和1、10、50、100、200、300μg/mL CBNPs染毒組處理16HBE細胞3、6、12、24、36h。加入MTT孵育后使用酶標儀檢測各孔在495nm波長處的吸光度值。每組設置六個復孔，計算各組吸光度并統(tǒng)計各染毒組細胞存活率。
　　4.細胞氧化應激水平的測定
　　將CBNPs染毒處理后的細胞制備成單細胞懸液，用2,7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（2,7-

5、dichlorodihydrf-luorescein diacetate,DCFH-DA）熒光探針進行孵育，流式細胞儀檢測不同劑量CBNPs處理后16HBE細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species,ROS）的含量；16HBE細胞內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性以及脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛（ma

6、lonaldehyde， MDA）含量采用生化試劑盒并按照說明書進行定量檢測。
　　5.細胞DNA損傷的測定
　　應用單細胞凝膠電泳（single cell gel ectrophoresis，SCGE）實驗，通過觀測染毒前后Olive尾踞的變化，檢測CBNPs對細胞DNA的損傷。
　　6.AnnexinⅤ-PI雙染檢測細胞凋亡
　　染毒24小時后將陰性對照和各染毒組細胞制備成單細胞懸液，采用AnnexinⅤ-F

7、ITC和PI雙染標記，于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　7.細胞周期檢測
　　將陰性對照和各染毒組制備成單細胞懸液，用-20℃預冷的80%的乙醇固定后，先后使用RNAseA和PI處理細胞，之后使用流式細胞儀進行周期檢測。
　　8.細胞周期的同步化
　　使用害羞草堿使16HBE細胞同步于G0/G1期，胸苷雙阻斷法使16HBE細胞同步于S期，諾考達唑使細胞同步于G2/M期。
　　9.細胞攝取CBNPs檢測

8、>　　將陰性對照和各染毒組16HBE細胞制備成單細胞懸液，經(jīng)PBS洗滌兩次后，應用流式細胞儀進行檢測，并通過 SSC密度含量的改變來定量分析16HBE對 CBNPs的攝取量。另外采用ImageStreamX單細胞成像流式細胞儀檢測各組樣本并獲取各劑量組細胞的明場及暗場圖像和數(shù)據(jù)，由此分析16HBE攝取CBNPs的情況。
　　結果：
　　1.納米炭黑顆粒表征
　　電子顯微鏡下觀察，納米炭黑為球狀顆粒。透射電鏡顯示炭黑顆粒

9、大體呈葡萄球狀，分散良好，顆粒直徑在30~50nm之間。掃描電鏡顯示炭黑顆粒近似呈球形，分散較均勻，團聚顆粒直徑大約200~400nm之間。較大顆粒表面有很多球形突出物。利用 BET比表面積測試法測量炭黑顆粒比表面積為74.85m2/g。炭黑顆粒難溶于水，在水溶劑中炭黑團聚顆粒直徑為200~400nm，而在0.04%Tween80中有較好的分散性，顆粒直徑為30~50nm。
　　2.CBNPs對16HBE細胞活性的影響
　　

10、當用100、200和300μg/mL CBNPs處理16HBE細胞3h后，各劑量組細胞存活率逐漸降低（P<0.05）；當用50、100、200和300μg/mL CBNPs處理16HBE細胞6h后，各劑量組細胞存活率逐漸降低（P<0.05）；當用1、10、50、100、200和300μg/mL CBNPs處理細胞12、24、36h后，各劑量組細胞存活率逐漸降低（P<0.05）；隨著染毒濃度和時間的增加，16HBE細胞活性降低更加明顯。這

11、些結果表明CBNPs抑制16HBE細胞存活并且這種抑制效應存在劑量和時間依賴性。
　　3.CBNPs誘導16HBE細胞凋亡
　　用50、100和200μg/mL的CBNPs處理16HBE細胞24小時。發(fā)現(xiàn)50μg/mL和100μg/mL CBNPs處理的16HBE早期凋亡細胞數(shù)目略微升高（P>0.05）；200μg/mL CBNPs處理可誘導16HBE細胞早期凋亡率顯著增加（P<0.05）；隨著CBNPs染毒濃度增加，晚期凋

12、亡細胞所占的百分率和細胞壞死細胞的百分率逐漸升高（P<0.05）。這些結果表明CBNPs對細胞增殖的抑制作用至少可以部分解釋為CBNPs誘導的凋亡和壞死。
　　4.CBNPs對16HBE細胞氧化損傷的測定
　　不同濃度CBNPs處理16HBE細胞24小時后，隨著染毒濃度的增加， ROS水平逐漸升高（P<0.05）；MDA含量逐漸增加（P<0.05）；SOD和GSH-Px活力隨CBNPs染毒濃度的增加而逐漸降低（P<0.05）

13、。說明CBNPs可以誘導16HBE細胞氧化損傷。
　　5.CBNPs對16HBE細胞DNA損傷的誘導作用
　　不同劑量的CBNPs處理16HBE細胞24小時后，隨著染毒濃度的增加，各劑量組Olive尾距顯著增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明CBNPs可以誘導16HBE細胞DNA損傷。
　　6.CBNPs對16HBE細胞周期的影響
　　用100μg/mL CBNPs對16HBE細胞進行連續(xù)

14、處理，發(fā)現(xiàn)CBNPs誘導S期和 G2/M期細胞比率增加（P<0.05）。S期細胞比率增加發(fā)生在6至24小時; G2/M期細胞比率增加發(fā)生在18至36小時。說明CBNPs誘導16HBE細胞周期阻滯，且阻滯發(fā)生于S期和G2/M期。
　　7.16HBE細胞對CBNPs的攝取
　　用50、100和200μg/mL的CBNPs處理16HBE細胞24小時，采用流式細胞儀和 ImageStreamX成像流式細胞儀進行檢測。發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)CBN

15、Ps量逐漸升高（P<0.05）；將16HBE細胞分別同步化于G0/G1期，S期和G2/M期并進行CBNPs染毒處理。經(jīng)6小時和24小時染毒后采用流式細胞儀檢測觀察到同步于S期和G2/M期的16HBE細胞比同步于G0/G1期的16HBE細胞有更高的CBNPs攝取量，其中同步于G2/M期的16HBE細胞對CBNPs攝取量最高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明不同細胞周期階段可以影響16HBE細胞對CBNPs的攝取效果。