肺癌患者鉑類藥物化療前后腸道菌群變化的相關(guān)研究.pdf

1、目的:近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤之首，并呈逐年上升的趨勢。因早期診斷困難，大多數(shù)患者確診時已處于晚期，以鉑類藥物為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合方案是標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案，臨床上鉑類藥物最常見的不良反應(yīng)是嚴重的惡心、嘔吐、食欲下降、腹痛等消化道不良反應(yīng)，這些不良反應(yīng)不但增加了患者的身心痛苦，降低了其生活質(zhì)量，而且限制了鉑類藥物的用藥劑量和強度，進而影響化療療效及預(yù)后。研究表明化療引起的消化道不良反應(yīng)與腸道菌群有著密切聯(lián)系，目前國內(nèi)外關(guān)于腸道菌

2、群與消化道以外其他腫瘤相關(guān)性的研究鮮有報道，對鉑類藥物化療后腸道菌群改變及其與消化道不良反應(yīng)之間關(guān)系的研究也甚少。本文通過對健康人及肺癌患者鉑類藥物化療前、化療后腸道菌群結(jié)構(gòu)和特定菌群的定性、定量分析，了解肺癌患者腸道菌群的改變，以及鉑類藥物化療對菌群的影響，旨在從微生態(tài)角度，提供一個評估宿主健康狀況及罹患肺癌風(fēng)險的檢測指標(biāo)，并為改善鉑類藥物引起的胃腸道不良反應(yīng)，提供新的思路和方法。
　　方法:1.采集臨床樣本:篩選2015年6月

3、-2015年11月初治于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的30例肺癌患者作為肺癌組，均接受以鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合方案化療，于化療前、后各采集新鮮糞便一次，將性別、年齡相匹配的20例健康人作為對照組，同期采集對照組新鮮糞便一次，采集后盡快置于-80℃冰箱保存。
　　2.提取細菌DNA:提取所收集樣本的腸道細菌基因組DNA。
　　3.利用PCR-DGGE（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—變性梯度凝膠電泳）法探究腸道菌群的整體變化:利用腸道細菌核糖體小亞

4、基RNA(16SrRNA)基因V3可變區(qū)通用引物引導(dǎo)PCR，擴增成功者，進行DGGE，切取指紋圖譜中的差異條帶，進行純化、克隆測序，將所得結(jié)果與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫比對，明確細菌種類。
　　4.RT-PCR（實時熒光定量—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）定量測定對照組及肺癌組化療前、化療后雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。
　　5.結(jié)果分析:利用Quantity One軟件進行DGGE圖譜條帶多樣性及相似性聚類分析。SPSS19.0軟件進

5、行PCA（主成分分析）及統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，兩組之間的比較用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)a=0.05（雙側(cè)概率法），P＜0.05提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.與健康對照組相比，肺癌組化療前腸道菌群的變化:
　　(1)DGGE指紋圖譜顯示，與對照組相比，肺癌組腸道菌群的多樣性減少，豐富度下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。聚類分析和PCA圖提示，肺癌組與對照組腸道菌群存在明顯的聚類差異。

6、>　　(2)經(jīng)RT-PCR定量檢測，對照組與肺癌組每克糞便中細菌的拷貝數(shù)分別為乳酸桿菌屬(8.17±1.14;7.49±0.96，雙歧桿菌屬(9.16±0.84;7.73±0.71)，肺癌組兩種菌的數(shù)量均較對照組減少(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.鉑類藥物化療后，肺癌組患者腸道菌群的改變:
　　(1)DGGE圖譜顯示，與化療前相比，肺癌組患者化療后腸道菌群的多樣性減少，豐富度下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意

7、義。聚類分析和PCA圖提示，化療前與化療后腸道菌群存在顯著的聚類差異。
　　(2)對DGGE圖譜上變化明顯的條帶切膠測序，與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示化療后有4個條帶亮度減弱，其中2條與瘤胃球菌屬（Ruminococcus sp.）、柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium sp.）的同源性分別為94％和90％，另外2條目前暫未獲得體外培養(yǎng)菌株。有1個條帶亮度增強，其與肺炎克雷伯菌（Klebsiella pn

8、eumoniae）同源性為99％。
　　(3)RT-PCR法定量檢測結(jié)果顯示，化療前、化療后每克糞便中細菌的拷貝數(shù)分別為乳酸桿菌屬(7.49±0.96;7.07±1.21)，雙歧桿菌屬（7.73±0.71;6.64±1.03），化療后這兩種菌的數(shù)量均減少(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(4)對比有胃腸道反應(yīng)組和無胃腸道反應(yīng)組，雙歧桿菌的數(shù)量在兩組間未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，乳酸桿菌的數(shù)量在兩組間也未見統(tǒng)計學(xué)差