線粒體tRNALeu(UUR)3253T＞C突變與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性功能研究.pdf

1、近年來，隨著我國居民生活方式和生態(tài)環(huán)境的改變及老齡化進(jìn)程的加速，高血壓和腦卒中等心血管疾病已經(jīng)成為我國突出的公共衛(wèi)生問題。據(jù)估算，目前全國高血壓患病人數(shù)約達(dá)2.7億，嚴(yán)重危害國民健康。高血壓是一種常見的慢性疾病，是一種由基因和環(huán)境等多種因素共同調(diào)控的疾病，而線粒體基因突變已報道與原發(fā)性高血壓相關(guān)。本課題通過對中國人群原發(fā)性高血壓患者進(jìn)行臨床資料及基因組測序篩查，以線粒體tRNA基因突變作為切入點，發(fā)現(xiàn)一個高外顯率的原發(fā)性高血壓家系攜帶t

2、RNALeu(UUR)3253T＞C突變，并通過生化功能實驗研究其對細(xì)胞功能的影響，探討tRNAL上u(UUR)3253T＞C突變與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。
　　目的:通過對一個攜帶tRNALu(UUR)3253T＞C突變的原發(fā)性高血壓家系構(gòu)建血小板融合細(xì)胞系，并對其進(jìn)行生化功能分析，探討線粒體tRNALeu(UUR)3253T＞C突變與原發(fā)性高血壓的相關(guān)功能研究;
　　方法:通過對原發(fā)性高血壓相關(guān)的線粒體tRNALeu(UU

3、R)3253T＞C突變的分子致病機制進(jìn)行研究。我們對2069個中國漢族原發(fā)性高血壓家系的線粒體基因進(jìn)行突變篩查，發(fā)現(xiàn)1個攜帶tRNALeu(UUR)3253T＞C突變的原發(fā)性高血壓家系，呈典型的母系遺傳。因此運用聚乙二醇誘導(dǎo)法將血小板與mtDNA缺失的ρ0206細(xì)胞融合，構(gòu)建了具有相同核背景的血小板融合細(xì)胞模型，對其進(jìn)行鑒定以便后續(xù)生化功能實驗，并利用熒光標(biāo)記檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧及膜電位變化、生物發(fā)光檢測細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量，測定線粒體氧化磷酸

4、化復(fù)合體酶活性，Northern Blot評估細(xì)胞線粒體tRNA穩(wěn)態(tài)及氨?；?，Western Blot定量分析線粒體DNA編碼的多肽合成量;
　　結(jié)果:先證者及其母系成員的線粒體基因全序列分析結(jié)果顯示，屬于東亞線粒體單體型D4。tRNALeu(UUR)3253T位點在進(jìn)化上高度保守，該位點對應(yīng)tRNALeu(UUR)二級結(jié)構(gòu)D莖的22位，tRNALu(UUR)3253T＞C突變可能影響與D莖13位和額外環(huán)46位的相互作用，進(jìn)而

5、影響tRNALeu(UUR)二級結(jié)構(gòu)的形成及穩(wěn)定性。成功構(gòu)建野生型和突變型血小板融合細(xì)胞系，生化功能結(jié)果顯示:突變型tRNALeu(UUR)分子的電泳遷移速率大于野生型分子，線粒體tRNALeu(UUR)氨?；壤骄档土?2.03％，突變細(xì)胞株的tRNALu(UUR)穩(wěn)態(tài)水平大約下降了31.10％，發(fā)現(xiàn)線粒體編碼的Cytb、ND1、ATP6和COXⅠ等4個蛋白質(zhì)表達(dá)量總體水平平均降低了50.15％。線粒體氧化磷酸化復(fù)合體Ⅲ和Ⅳ酶活力

6、明顯降低，復(fù)合體Ⅰ和Ⅱ酶活力無顯著性差異。線粒體電子傳遞鏈的缺陷導(dǎo)致線粒體ATP產(chǎn)生量下降了35.77％，而攜帶線粒體tRNAL（UUR)3253T＞C突變的血小板融合細(xì)胞株線粒體膜電勢下降了41.20％，從而導(dǎo)致ROS產(chǎn)生量增加28.32％。
　　結(jié)論:綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)的母系遺傳原發(fā)性高血壓的發(fā)生與線粒體tRNALeu(UUR)3253T＞C突變相關(guān)。線粒體tRNALeu(UUR)3253T＞C突變影響tRNALeu(UUR