灑精對(duì)大鼠腦內(nèi)血管超微結(jié)構(gòu)及CD146蛋白表達(dá)變化的影響.pdf

1、過量飲酒對(duì)健康造成極大損害，并引發(fā)眾多不良社會(huì)后果，每年造成約250萬人死亡，更為可怕的是越來越多的年輕人受到影響。世界衛(wèi)生組織發(fā)表的《酒精與健康全球狀況報(bào)告》中指出，酒精是世界上第三大導(dǎo)致疾病的危險(xiǎn)因素。國內(nèi)外研究表明大量飲酒可通過多種途徑促進(jìn)腦血管意外的發(fā)生，但其具體機(jī)制尚未明了。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，大量飲酒后輕度外力作用導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的案件較為常見，大量飲酒對(duì)腦血管的損傷以及飲酒在此類案件中的參與度問題成為法醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)

2、學(xué)及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究焦點(diǎn)。CD146為黑色素瘤粘附分子，在所有人血管內(nèi)皮細(xì)胞上成陽性表達(dá)，為血管內(nèi)皮粘附分子。
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃诮⒋笫箫嬀颇Ｐ偷幕A(chǔ)上，采用頂空氣相色譜儀檢測(cè)大劑量飲酒后血乙醇濃度(BAC)的變化情況；應(yīng)用自動(dòng)凝血分析檢測(cè)儀測(cè)定飲酒不同時(shí)間大鼠凝血功能系列指標(biāo)，觀察分析各指標(biāo)變化的內(nèi)在聯(lián)系；通過HE染色、免疫組織化學(xué)染色以及透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)與方法，深入觀察飲酒大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞間連接

3、的改變，觀察CD146在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)情況，探討其在大量飲酒后內(nèi)皮細(xì)胞連接改變中的作用，進(jìn)一步闡明大量飲酒對(duì)腦血管的影響及作用機(jī)制，為飲酒后輕度外力作用導(dǎo)致SAH案件的飲酒參與度鑒定提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重220g±10g，用市售白酒北京紅星二鍋頭(56％v/v)制備模型，采用大鼠灌胃器進(jìn)行灌胃，實(shí)驗(yàn)前均給予適應(yīng)性蒸餾水灌胃1周。
　　 1、不同時(shí)間BAC測(cè)

4、定：取6只220g±10g雄性SD大鼠，以56％v/v1.2mL/100g給予白酒灌胃一次，分別于灌胃后0.5h、1h、2h、3h、6h、12h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，由內(nèi)眥眶內(nèi)靜脈叢取血，左右眼輪換，每次每只取血約200-300μl，密封。應(yīng)用頂空氣相色譜儀檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)BAC，確定該劑量白酒灌胃后BAC峰值的出現(xiàn)時(shí)間。
　　 2、將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、飲酒1次組、飲酒7天組、飲酒14天組、飲酒21天組、飲酒28天組。飲

5、酒各組以56％v/v1.2mL/100g/次的灌酒量進(jìn)行灌胃。除飲酒1次組，其他各飲酒組每天白酒灌胃2次，間隔10小時(shí)。正常對(duì)照組用等體積蒸餾水代替白酒進(jìn)行灌胃。在此期間觀察大鼠的行為學(xué)改變，測(cè)量并記錄大鼠體重變化情況，記錄存活情況。各組末次灌胃后抽取心血，斷頭取腦組織、肝臟組織。取血后全自動(dòng)凝血分析儀檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）及纖維蛋白原（FBG）。肝組織制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色觀

6、察；全腦固定制作石蠟切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠腦血管CD146蛋白的表達(dá)變化；應(yīng)用TEM觀察大鼠基底動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈的病理損傷情況。
　　 數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析（ANOVA），用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，以P＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、大鼠行為學(xué)改變，體重變化：大鼠白酒灌胃操

7、作較蒸餾水灌胃困難。大鼠飲酒后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)不同程度的興奮性增加的表現(xiàn)，20min后逐漸出現(xiàn)昏睡，翻正反射消失等急性酒精中毒臨床表現(xiàn)。隨著后期實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長，飲酒組進(jìn)食量減少，灌胃時(shí)抵抗反應(yīng)減輕，飲酒后未見明顯興奮性增強(qiáng)表現(xiàn)，活動(dòng)性減弱，反應(yīng)遲鈍，給予灌酒14天后個(gè)別大鼠出現(xiàn)肢體偏癱。體重增長緩慢，21天組和28天組大鼠體重與對(duì)照組相比增長明顯減少。
　　 2、BAC:按照56％v/v1.2mL/100g劑量給予大鼠一次性灌酒，BA

8、C在0.5小時(shí)為190.29±29.34mg/dl，至1小時(shí)濃度達(dá)到峰值，為225.06±43.10mg/dl，2小時(shí)BAC為194.08±32.30mg/dl，之后濃度逐漸下降，至12h為25.37±18.21mg/dl。說明大鼠飲酒后約1-2h乙醇吸收達(dá)高峰。
　　 3、凝血功能指標(biāo)檢測(cè)：各組末次灌胃后2小時(shí)采取血漿。飲酒14天組TT明顯縮短，與其他各組均有顯著差異；飲酒14天組PT延長，與其他各組均有顯著差異；飲酒各組AP

9、TT與正常對(duì)照組沒有明顯差異；飲酒7天組FBG延長，與其他各組有顯著差異。
　　 4、組織病理學(xué)改變
　　 4.1肝臟病理學(xué)改變：對(duì)照組可見肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰；飲酒1次組可見肝細(xì)胞水腫伴部分肝細(xì)胞輕度脂肪變性，隨著飲酒時(shí)間的增加可見肝細(xì)胞脂肪變性的加重，炎細(xì)胞聚集，進(jìn)而又出現(xiàn)多發(fā)片狀壞死。
　　 4.2CD146免疫組織化學(xué)結(jié)果：正常對(duì)照組以及飲酒各組腦實(shí)質(zhì)微血管、靜

10、脈、蛛網(wǎng)膜下腔血管和基底動(dòng)脈血管壁均有CD146陽性表達(dá)，其中動(dòng)脈血管壁主要在平滑肌層表達(dá)，靜脈及微血管在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)明顯。其中對(duì)照組表達(dá)為(+)，1次灌酒組所有類型血管中陽性表達(dá)為弱陽性（±），7天組、14天組、21天組各類血管陽性表達(dá)逐漸加強(qiáng)（++～++++），28天組陽性表達(dá)明顯減弱（±）。在各實(shí)驗(yàn)組中，腦實(shí)質(zhì)毛細(xì)血管及微小血管陽性表達(dá)的變化較基底動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈及其他小動(dòng)脈明顯。
　　 4.3腦基底動(dòng)脈、腦中動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)

11、改變：實(shí)驗(yàn)7天組內(nèi)皮細(xì)胞間連接開始出現(xiàn)小階段融合，實(shí)驗(yàn)14天組至28天組內(nèi)皮細(xì)胞損傷逐漸加重，出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間質(zhì)可見圓形大空泡，新生吞飲小泡增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆?，F(xiàn)象。表面微絨毛卷曲，微絨毛凸起減少，細(xì)胞間緊密連接融合部分逐漸增加，模糊不清。各組基底動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的改變與大腦中動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞變化未見明顯不同。
　　 結(jié)論：
　　 1、飲酒不同時(shí)期處死大鼠（處死時(shí)間均在飲酒后2小時(shí))，檢測(cè)結(jié)果表明大鼠凝