伏隔核miR-382及AKT3對線索誘導(dǎo)海洛因復(fù)吸的作用.pdf

1、目的：阿片類藥物成癮已成為我國公共衛(wèi)生健康中重大社會問題之一。目前臨床治療藥物成癮的最大難點(diǎn)是成癮患者的心理渴求和藥物復(fù)吸行為。研究發(fā)現(xiàn)藥物成癮的主要病理生理機(jī)制是腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的基因和蛋白表達(dá)產(chǎn)生適應(yīng)性改變。最近發(fā)現(xiàn)，miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，與藥物成癮關(guān)系密切。但缺少miRNA在海洛因成癮復(fù)吸中的作用機(jī)制研究。本課題旨在研究大鼠海洛因成癮及戒斷線索誘導(dǎo)復(fù)吸后伏隔核的miRNA表達(dá)譜變化，選擇miR-

2、382作為研究對象，對其生物學(xué)功能進(jìn)行系統(tǒng)的探索。
　　實(shí)驗(yàn)一、依據(jù)芯片分析結(jié)果對 miR-382表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證
　　方法：雄性 SD大鼠經(jīng)海洛因自身給藥訓(xùn)練成癮后備用，實(shí)驗(yàn)分三組：空白對照組（Control，n=6），海洛因成癮大鼠隨機(jī)分成兩組：戒斷第一天線索誘導(dǎo)復(fù)吸組（CS1，n=6）和戒斷14天線索誘導(dǎo)復(fù)吸組(CS14,n=6)。Control組與CS1組大鼠于海洛因戒斷第一天斷頭取伏隔核，CS14組大鼠于戒斷14天后斷

3、頭取伏隔核，運(yùn)用 RT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測 miR-382的表達(dá)變化是否與芯片一致
　　結(jié)果：三組大鼠伏隔核經(jīng) RT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，CS1組大鼠伏隔核 miR-382的表達(dá)顯著增加[t(4)=5.185,p<0.05]。與 CS1組比較，大鼠戒斷14天后 miR-382的表達(dá)顯著減低[t(4)=6.448,p<0.05]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與芯片結(jié)果相一致。
　　實(shí)驗(yàn)二通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測 miR-382對

4、 AKT3基因表達(dá)的作用
　　方法：將 AKT3基因的熒光質(zhì)粒（AKT3WT，AKT3mutant，control）0.1μg，miRNA-382質(zhì)粒（miRNA-382和 miRNA-382 NC）0.4μg，Renilla質(zhì)粒0.02μg通過 X-tremegene HP（ROCHE）試劑盒，在24孔板，500μL/well，共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分六組：control+miRNA-382，control+ miRNA-3

5、82-NC，AKT3WT+ miRNA-382，AKT3WT+ miRNA-382-NC，AKT3 MU+ miRNA-382，AKT3 MU+ miRNA-382-NC)，轉(zhuǎn)染48h后使用 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)檢測各組熒光表達(dá)值。觀察 miR-382對 AKT3WT組熒光蛋白的表達(dá)作用。
　　結(jié)果：AKT3WT+miRNA-382組的熒光表達(dá)量顯著低于 AK

6、T3WT+miRNA-382-NC[t(4)=34.77,p<0.05]和 AKT3mutant+miRNA-382組[t(4)=14.7，p<0.05]。結(jié)果提示 miR-382通過與 AKT3mRNA堿基互補(bǔ)配對抑制 AKT3基因的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)三觀察大鼠戒斷14天后線索誘復(fù)吸對 AKT3蛋白表達(dá)的影響
　　方法：實(shí)驗(yàn)分兩組：空白對照組（control,n=6）及戒斷14天后線索誘導(dǎo)復(fù)吸組（CS14,n=6）,將兩組大

7、鼠麻醉后斷頭取腦，取伏隔核，運(yùn)用 RT-PCR及Western blot檢測兩組伏隔核 AKT3mRNA和 AKT3蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：兩組大鼠斷頭取伏隔核，經(jīng) Western blot實(shí)驗(yàn)及 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測后，與空白對照組比較，發(fā)現(xiàn) AKT3蛋白[t(6)=3.92，p<0.05]及AKT3mRNA[t(4)=13.86，p<0.05]在 CS14組表達(dá)顯著增高。結(jié)果說明，AKT3基因在線索誘導(dǎo)的大鼠海洛因復(fù)吸過程

8、發(fā)揮了重要的作用。
　　實(shí)驗(yàn)四觀察伏隔核高表達(dá) miR-382對線索誘導(dǎo)的大鼠海洛因復(fù)吸行為作用并對 AKT3蛋白表達(dá)進(jìn)行分析
　　方法：將成功建立海洛因成癮的大鼠隨機(jī)分成三組，戒斷14天后線索誘導(dǎo)復(fù)吸組（CS14，n=8），陰性病毒組（LV-GFP,n=10），miR-382表達(dá)組（LV-miR-382,n=8），三組大鼠有效鼻觸無顯著差異，LV-GFP組和 LV-miR-382組于戒斷第一天通過腦立體定位，在伏隔核注入相

9、應(yīng)慢病毒。三組大鼠于戒斷14天后進(jìn)行2小時(shí)線索誘導(dǎo)復(fù)吸測試，檢測 miR-382高表達(dá)后對線索誘導(dǎo)的海洛因復(fù)吸行為的作用，然后斷頭取伏隔核，分別行 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測 miR-382及AKT3mRNA表達(dá)，和 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測 AKT3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：通過 RT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與 LV-GFP組比較，LV-miR-382組大鼠 miR-382在伏隔核成功過表達(dá)[t(7)=2.45,p<0.05]

10、，并顯著抑制該組大鼠線索誘導(dǎo)的海洛因復(fù)吸行為[t(16)=2.56,p<0.05]，AKT3蛋白在伏隔核表達(dá)顯著性減低[t(4)=2.92,p<0.05]，但各組間 AKT3mRNA的表達(dá)未見明顯差異(p>0.05)。結(jié)果提示，在伏隔核高表達(dá) miR-382可顯著抑制線索誘導(dǎo)的海洛因復(fù)吸行為，并抑制 AKT3蛋白的表達(dá)，但不引起 AKT3mRNA的降解。
　　實(shí)驗(yàn)五伏隔核注射 AKT3siRNA對大鼠海洛因成癮復(fù)吸行為的作用并對

11、AKT3蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析
　　方法：將成功建立海洛因成癮的大鼠隨機(jī)分成三組，戒斷14天后線索誘導(dǎo)復(fù)吸組（CS14，n=9），陰性病毒組（LV-GFP,n=9），AKT3表達(dá)抑制組（LV-siRNA-AKT3,n=9），三組大鼠有效鼻觸無顯著差異，LV-GFP組和 LV-siRNA-AKT3組于戒斷第一天通過腦立體定位，在伏隔核注入相應(yīng)慢病毒。三組大鼠于戒斷14天后進(jìn)行2小時(shí)線索誘導(dǎo)海洛因復(fù)吸測試，斷頭取伏隔核檢測 AKT3蛋白表

12、達(dá)，分別進(jìn)行 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢 AKT3mRNA表達(dá)和 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測AKT3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：與LV-GFP組比較，LV-AKT3-siRNA組大鼠伏隔核注射 AKT3siRNA后顯著抑制線索誘導(dǎo)海洛因復(fù)吸行為[t(16)=2.939,p<0.05]。AKT3蛋白的表達(dá)顯著減低[t(8)=3.69,p<0.05]，AKT3mRNA表達(dá)顯著抑制[t(10)=2.86,p<0.05]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠海洛

13、因成癮后降低伏隔核 AKT3蛋白的表達(dá)可顯著抑制線索誘導(dǎo)的海洛因復(fù)吸行為。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)大鼠海洛因成癮戒斷后 miR-382在伏隔核中的表達(dá)降低，升高miRNA-382在伏隔核表達(dá)可抑制線索誘導(dǎo)的海洛因復(fù)吸行為。而后運(yùn)用熒光雙素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和在體實(shí)驗(yàn)證明 AKT3為 miRNA-382作用的靶基因。同時(shí)又通過減低AKT3在伏隔核表達(dá)可抑制線索誘導(dǎo)的海洛因復(fù)吸行為。綜上述研究結(jié)果表明：伏隔核 miRNA-382對