純鈦表面親水性能的維持與恢復(fù)及其對(duì)成骨細(xì)胞生物活性影響的研究.pdf

1、近半個(gè)世紀(jì)以來，人工種植牙得到了臨床上的認(rèn)可，獲得了廣泛的應(yīng)用，但是還存在一些需要解決的問題:①臨床上植入體內(nèi)的種植體達(dá)到可以負(fù)載的時(shí)間比較長，②良好的骨結(jié)合是種植體成功的關(guān)鍵，但現(xiàn)在的種植體與骨的結(jié)合率仍然較低，這將對(duì)種植體的長期穩(wěn)定有消極的影響。有大量的研究表明，種植體的失敗大部分發(fā)生在愈合早期，那么在愈合早期防止不利因素的發(fā)生顯得尤為重要。
　　近幾年來，鈦材料的親水性表面對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)作用已逐漸得到了研究者的認(rèn)可，親水

2、性表面能夠提高成骨細(xì)胞的粘附率，明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，對(duì)于骨結(jié)合有積極的作用。但有研究表明鈦片表面的親水性能有一定的時(shí)效性，會(huì)隨著放置時(shí)間的延長越來越弱，這將不利于骨結(jié)合。在保存過程中種植體的親水性能或多或少發(fā)生了變化，如何維持親水性能這值得我們深入研究。
　　由于在臨床工作中，往往臨床醫(yī)生拿到鈦種植體時(shí)都已經(jīng)經(jīng)過或長或短的保存時(shí)間，其表面的親水性能很可能已經(jīng)出現(xiàn)了降低，與之相應(yīng)的生物學(xué)性能也就有所下降。因此，如何使種植體

3、的表面維持親水狀態(tài)是一個(gè)重要的研究課題。本研究從處理方法的角度出發(fā)，研究不同處理方法對(duì)親水特性長期維持的影響，以盡可能保持鈦片表面的超親水性能，使應(yīng)用到臨床的種植體能夠擁有更佳的骨結(jié)合效果。
　　目的：
　　1、探究鈦片經(jīng)過NaOH溶液處理是否可以維持或者恢復(fù)其表面的親水性能。
　　2、探討鈦片表面親水特性與生物學(xué)性能之間的關(guān)系。
　　方法：
　　1、鈦片的制備及分組
　　將TA4純鈦切割成兩種規(guī)格:

4、一種為直徑15mm，厚度1.5mm;另一種為直徑10mm，厚度1.5mm。分別一半進(jìn)行噴砂酸蝕(SLA)處理，另一半進(jìn)行等離子體氧化處理，在進(jìn)行等離子體氧化處理之前，鈦片試樣均已進(jìn)行過噴砂酸蝕處理，試樣放進(jìn)真空室前，試樣依次在去離子水和無水乙醇中各超聲清洗5min，烘干冷卻后直接放入真空室，并開始抽真空。氧化前鈦片表面進(jìn)行了Ar等離子體的清洗，所有樣片表面形態(tài)較為均勻，表面清潔度良好。分組:
　　組1:SLA鈦片常溫常壓空氣中保存

5、10天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡稱SLA;
　　組2:SLA鈦片常溫常壓空氣中保存10天后0.1M NaOH液體浸泡10s進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡稱SLA+短堿;
　　組3:等離子體氧化鈦片常溫常壓空氣中保存10天后0.1M NaOH液體浸泡10s進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡稱氧化+短堿;
　　組4:等離子體氧化鈦片常溫常壓保存于0.1MNaOH液體中10天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡稱氧化+長堿（此組樣片于真空環(huán)境下制備后直接置于NaOH液體中，整個(gè)過程未接觸空氣）。

6、>　　以上試驗(yàn)均在清潔環(huán)境中完成。
　　2、鈦片表面理化性能的檢測
　　通過掃描電鏡觀察鈦片表面的形貌，利用水接觸角分析儀分析鈦片表面親水性，從而用以評(píng)估實(shí)驗(yàn)中四組鈦片表面的理化性能的差異。
　　3、蛋白吸附試驗(yàn)
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用兩種蛋白為模型蛋白:牛血清白蛋白(BSA)和人纖連蛋白(FN)，利用BCA蛋白濃度測試試劑盒法在波長562nm波長下測定OD值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)的吸附率（百分比）。
　　4

7、、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
　　本實(shí)驗(yàn)選用MC3T3-E1成骨細(xì)胞系，在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，通過細(xì)胞骨架染色法、掃描電鏡法、MTT法、ALP試劑盒法對(duì)成骨細(xì)胞的粘附鋪展、增殖及分化情況進(jìn)行分析，用來分析比較本實(shí)驗(yàn)中四組鈦片表面的細(xì)胞生物學(xué)活性。
　　統(tǒng)計(jì)分析
　　采用Spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)各組樣品的蛋白質(zhì)吸附率、細(xì)胞增殖和分化方面各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測定結(jié)果用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，組間進(jìn)行單因素方差分析，假設(shè)檢驗(yàn)為雙側(cè)

8、檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)P＜0.01時(shí)，認(rèn)為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、材料理化性能分析
　　1、掃描電鏡觀察結(jié)果:SLA以及氧化的鈦片均具有典型的噴砂酸蝕后的表面形態(tài)，表現(xiàn)為表面呈現(xiàn)較均勻的多孔狀結(jié)構(gòu)，孔徑為1-5μm，說明等離子體氧化并不能改變鈦片表面的形貌。氧化鈦片在0.1mol/L的堿液(pH=13)浸泡前后的表面形貌也沒有明顯變化，說明此堿液

9、并不能并改變鈦片表面的形貌。
　　2、經(jīng)過靜態(tài)水接觸角檢測可得結(jié)果，四組材料表面的靜態(tài)水接觸角大小從高到低為SLA＞氧化+短堿＞SLA+短堿＞氧化+長堿，而接觸角越小親水性能越高。
　　二、材料的蛋白吸附實(shí)驗(yàn)
　　四組不同處理方法鈦片的蛋白吸附率結(jié)果顯示:在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均是氧化+長堿組鈦片表面的蛋白質(zhì)吸附率最高，而SLA鈦片表面的蛋白吸附能力最弱。
　　三、材料生物學(xué)性能分析
　　1、成骨細(xì)胞在材料表面的粘附

10、鋪展情況
　　在四組材料表面，成骨細(xì)胞接種培養(yǎng)6h后SLA短堿、氧化短堿和氧化長堿材料表面均出現(xiàn)了成骨細(xì)胞的絲足結(jié)構(gòu)，并且組4偽足要較其他組長，而SLA材料表面成骨細(xì)胞剛剛見到伸展形態(tài)，尚無此結(jié)構(gòu)。細(xì)胞培養(yǎng)24h后可見SLA短堿、氧化短堿和氧化長堿材料表面絲足結(jié)構(gòu)已經(jīng)生長為片足結(jié)構(gòu)，而SLA材料表面也已經(jīng)出現(xiàn)了剛剛伸張為絲足的結(jié)構(gòu)。48h后細(xì)胞在四組材料上的形態(tài)無明顯的差別，都表現(xiàn)出正常的成骨細(xì)胞形態(tài)。
　　2、成骨細(xì)胞在材

11、料表面的增殖情況
　　通過MTT法檢測，成骨細(xì)胞培養(yǎng)1d、3d、5d、7d后，四組材料表面的細(xì)胞數(shù)量均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增多，在四個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)，四組材料表面成骨細(xì)胞的增殖情況由高到低排列均為:氧化長堿＞氧化短堿＞SLA短堿＞SLA。
　　3、成骨細(xì)胞在材料表面的分化情況
　　細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性測定結(jié)果為，分別培養(yǎng)3d、5d、10d和15d后四組材料表面的成骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性均為隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增強(qiáng)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)AL

12、P活性的高低順序均為:氧化長堿＞氧化短堿＞SLA短堿＞SLA。
　　4、成骨細(xì)胞在材料表面的細(xì)胞骨架形態(tài)
　　培養(yǎng)1h后，SLA及SLA短堿材料表面成骨細(xì)胞大部分還是圓形，未見鋪展，氧化短堿材料表面細(xì)胞初見鋪展，細(xì)胞鋪展面積未見明顯增加，而氧化長堿材料表面成骨細(xì)胞鋪展面積較其它3組要大，并且?guī)缀跛屑?xì)胞均有鋪展。培養(yǎng)2h后，相比1h時(shí)四組均未見明顯變化。培養(yǎng)4h后，四組材料鋪展面積均增加，有明顯的伸展，并且四組鋪展面積由高到

13、底為:氧化長堿＞氧化短堿＞SLA短堿＞SLA。培養(yǎng)24h后，所有細(xì)胞均明顯增大，伸展長度均明顯增加，并且各組材料之間細(xì)胞的形態(tài)與大小均沒有明顯的區(qū)別。
　　結(jié)論：
　　1、常溫常壓空氣中保存的純鈦，其表面親水性能一旦降低，應(yīng)用0.1mol/LNaOH溶液短暫處理可以恢復(fù)一定程度的親水性能，但未能恢復(fù)其超親水性狀態(tài)。
　　2、將自始至終未接觸過空氣的純鈦一直保存于NaOH溶液中能夠較好的維持其表面的超親水性性能。