FGF21在大腦神經(jīng)元細胞和腦內皮細胞中的表達和與受體的相互作用.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述：
　　第一部分 成纖維生長因子21(FGF21)對糖尿病鼠的快速降糖作用
　　目的:已有大量研究表明FGF21對糖代謝有調控作用，連續(xù)給藥7到14天后可以降低2型糖尿病型高血糖，還能增強胰島素的敏感性，降低胰島素抵抗。但很少有研究FGF21的快速降糖的作用?？焖俳堤菍τ谝愿哐菫椴l(fā)癥或者為主要危險因素的疾病例如急性創(chuàng)傷、炎癥以及心腦血管疾病等有重要的意義。
　　方法:本實驗先用溫州醫(yī)學

2、院提供的人重組FGF21蛋白注射2型糖尿病小鼠（T2D小鼠）14天，用血糖試紙檢測小鼠隨機血糖。再用Elisa法檢測小鼠胰島素水平。之后，在注射FGF211小時后，用血糖試紙檢測小鼠血糖。
　　結果:小鼠隨機血糖明顯下降并且增強了胰島素敏感性和降低了胰島素抵抗。注射FGF211小時后，T2D小鼠血糖和模擬應激性高血糖小鼠血糖都明顯下降。
　　結論：FGF21可能也有快速降低血糖的作用。
　　第二部分 血清FGF21水平

3、對腦內FGF21表達水平的影響
　　目的:有研究表明FGF21在患有心血管疾病、肝臟疾病、高血壓、肥胖、糖尿病等疾病時血清水平顯著增加?？赡艿臋C制是機體是對FGF21的信號傳導發(fā)生了障礙，對FGF21的敏感性減弱，才使FGF21過量表達。非常重要一點是有研究表明FGF21可以穿過血腦屏障(BBB)。但同時有研究發(fā)現(xiàn)FGF21需要通過細胞上的穿膜蛋白β-Klotho才能與成纖維因子受體(FGFR)結合而激活受體，這使FGF21的作用

4、有組織選擇性。而FGF21是否能進入大腦，大腦中是否有β-Klotho的表達和FGF21的受體激活機制還沒有研究。
　　方法:本實驗用Elisa法檢測非高血糖小鼠(ND小鼠)和2型糖尿病高血糖小鼠(T2D) FGF21血清水平。用western blot檢測ND小鼠的T2D小鼠的全腦蛋白做中FGF21表達水平。用western blot檢測靜脈注射外源性FGF21至小鼠后，同的時間點小鼠大腦的不同部位的FGF21、pFGFR1和β

5、-Klotho的表達水平。
　　結果:血清中FGF21在T2D小鼠中明顯高于ND小鼠。T2D小鼠大腦蛋白中的FGF21表達顯著性高于ND小鼠。靜脈注射外源性FGF21至小鼠后不同的時間點收集大腦蛋白，做western blot檢測，發(fā)現(xiàn)大腦不同部分FGF21的表達的和成纖維成長因子受體1(FGFR1)的磷酸化都發(fā)生了變化，并且檢測到了β-Klotho的表達。
　　結論：表明了血清中FGF21的升高對大腦中FGF21的含量和F

6、GFR1受體的激活有影響。但腦中FGF21的含量升高除了外源性FGF21直接進入，是否還存在被誘導升高尚不清楚;FGFR1的磷酸化是FGF21直接激活還是FGF21誘導了其他FGF家族的因子升高而激活的也尚不能定論，但由于檢測到了β-Klotho的表達，也有可能可以直接激活受體。這一結果表明FGF21可以穿過血腦屏障進入大腦，也許可以直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生作用。
　　第三部分 FGF21對腦內皮細胞的影響
　　目的:神經(jīng)

7、保護不局限于神經(jīng)元細胞的保護，對血腦屏障的保護也非常關鍵。血清中升高的FGF21直接接觸到血管內皮細胞，但FGF21對血管內皮細胞是否有保護作用目前以及保護機制沒有研究。在血管內皮中FGF21的表達和損傷后的表達變化，傳導通路和作用機制，以及受體復合物形式都有待研究。
　　方法:本研究應用Western blot檢測FGF21在血管內皮細胞中的表達，缺氧缺糖(OGD)4小時再復氧復糖20小時候后FGF21的表達變化，以及血管內皮細

8、胞被重組FGF21蛋白處理后磷酸化FGFR1和β-Klotho的表達變化，是否對FGF21有時間依賴和劑量依賴。使用RNA干擾(SiRNA)技術，轉染FGF21SiRNA后用Western blot檢測分析，以確認血管內皮中FGF21細胞中的表達。轉染β-Klotho SiRNA后用Western blot和免疫熒光來觀察在β-Klotho基因沉默后，F(xiàn)GFR1能否被FGF21激活以及FGF21/磷酸化FGFR1/β-Klotho在血管

9、內皮細胞上是否共定位。用MTT檢測外源性FGF21能否對腦血管內皮細胞在OGD4小時復糖復氧20小時的損傷產(chǎn)生保護作用。用FITC檢測高糖炎癥損傷下FGF21對內皮細胞滲透性保護。用western blot檢測FGF21通過誘導哪個蛋白升高來進行保護作用。
　　結果:首次發(fā)現(xiàn)腦血管內皮細胞中FGF21有表達且能被細胞缺氧缺糖后再灌注損傷誘導表達增加。FGF21在腦血管內皮細胞中能激活FGFR1磷酸化并同時誘導β-Klotho表達增

10、高，且FGF21/磷酸化FGFR1/β-Klotho這三者是在細胞是是共定位的。但在β-Klotho基因沉默后FGF21不能激活FGFR1。這一結果說明了在除了脂肪細胞，在腦血管內皮細胞中， FGF21的傳導通路也是通過FGF21/FGFR1/β-Klotho三聚體復合物的形成，激活FGFR1磷酸化而進行信號傳導的。
　　結論：這是首次發(fā)現(xiàn)FGF21在非脂肪細胞組織，在腦內皮細胞中也是通過FGF21/FGFR1/β-Klotho三

11、聚體復合物進行信號傳導的，提示這也許是FGF21信號傳導的共性。并且外源性FGF21對腦血管內皮細胞的缺氧缺糖后再灌注損傷和高糖合并炎癥損傷都有保護作用。FGF21還對內皮細胞在高糖合并炎癥損傷下減少其通透性的保護作用，其作用是通過誘導升高PPARγ實現(xiàn)的。FGF21還可以升高細胞膜連接蛋白ZO-1、VE-Cadherin連減少細胞通透性。
　　第四部分:FGF21對神經(jīng)元細胞的影響
　　目的:之前的實驗證實了FGF21能穿

12、過血腦屏障，而神經(jīng)元作為最重要的神經(jīng)功能性細胞，F(xiàn)GF21對神經(jīng)元細胞能否產(chǎn)生保護作用還沒有研究。并且FGF21在神經(jīng)元細胞中有無表達，或能否對FGF21的刺激產(chǎn)生反應，以及FGF21在神經(jīng)元細胞的受體和信號傳導通路是什么。都還有待研究。
　　方法:本研究應用Western blot檢測分析小鼠原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元細胞正常情況下和缺氧后的FGF21表達變化，和小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞被重組FGF21蛋白處理后磷酸化纖維生長因子受體

13、1(FGFR1)和β-Klotho的表達變化，是否對FGF21有時間依賴和劑量依賴。用免疫熒光染色檢測磷酸化FGFR1和β-Klotho能否被FGF21誘導和是否與FGF21共定位。用Co-IP和Western blot檢測分析FGF21是否能與FGFR1和β-Klotho形成三聚體復合物。用LDH檢測外源性FGF21蛋白能否對小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞缺氧或高糖損傷時產(chǎn)生保護作用。
　　結果:小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞正常情況下FGF2

14、1的表達量極低，但在缺氧損傷后FGF21能被誘導表達增加。在小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞中可以看到FGF21/磷酸化FGFR1/β-Klotho是共定位的，且FGFR1被FGF21激活磷酸化。在小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞正常狀態(tài)下，F(xiàn)GF21表達量太低，并不會形成FGF21/FGFR1/β-Klotho三聚體復合物，F(xiàn)GFR1/β-Klotho也不會形成二聚體復合物。但小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞被重組FGF21蛋白處理后，可以觀測到FGF21/FGF