磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4結(jié)構(gòu)和功能特證性研究以及與2型糖尿病的關(guān)聯(lián).pdf

1、第一部分引言
　　糖尿病正在成為一種全球性流行病，嚴(yán)重威脅人們健康；其中90％以上為2型糖尿病(T2D)。T2D是一個多因子誘發(fā)的疾病，是包括遺傳及環(huán)境因素在內(nèi)的多種因素共同作用的結(jié)果。
　　本研究中全面收集、掌握一T2D家族譜系，對其主要成員進(jìn)行全基因組外顯子測序，首次發(fā)現(xiàn)、篩選出突變基因——PEBP4；為闡明 PEBP4與T2D之間的關(guān)系，首先采用生物信息學(xué)方法比較 PEBP1-4基因序列以及mPEBP4與hPEBP4異

2、同及其特點；為檢測PEBP4是否為分泌型，分別將Myc、GFP表位分別放置在PEBP4的N-端/C-端，檢測PEBP4在細(xì)胞/培養(yǎng)液中表達(dá)，以及細(xì)胞內(nèi)的定位；在生物信息學(xué)的序列比對中，發(fā)現(xiàn)在PEBP4的基因序列中存在N-糖基化位點；運用蛋白質(zhì)組學(xué)、基因定點突變和質(zhì)譜分析等手段，確認(rèn)此糖基化位點的作用；為探討PEBP4 N端-/C-端作用機(jī)制，采用shRNA轉(zhuǎn)染HEK293T沉默PEBP4，使用ERK/Akt激活劑EGF、蛋白免疫印跡等，

3、探討PEBP4與ERK/Akt的調(diào)控關(guān)系；最后，尚構(gòu)建敲除PEBP4基因小鼠，篩選純合子后，觀察雌性小鼠體形/體重、空腹血糖、糖耐量能力等指標(biāo)，初步探討PEBP4對機(jī)體代謝可能的影響，為今后深入研究PEBP4在T2D等代謝性疾病中的作用及其意義奠定理論與實驗基礎(chǔ)。
　　第二部分糖尿病家族譜系中的 PEBP4基因突變
　　目的：全面了解先證者家族中 T2D患病情況，有無遺傳傾向或是基因突變。
　　方法：根據(jù)T2D診斷標(biāo)準(zhǔn)

4、，全面收集、掌握先證者及其家族成員有關(guān)癥狀、體征以及實驗室檢測結(jié)果；對先證者及其兄、弟、妹三人抽外周血作全基因組外顯子測序，尋找突變基因及位點。
　　結(jié)果：先證者父親兄弟二人、先證者及其三位兄、弟、妹以及二位堂兄弟和二位堂姐妹均在40歲左右診斷患有 T2D；先證者與兄、弟、妹四人均發(fā)現(xiàn)PEBP4基因突變。
　　結(jié)論：該T2D患者家族遺傳傾向極為明顯；首次發(fā)現(xiàn)T2D家族譜系中存在PEBP4基因突變。
　　第三部分 PEB

5、P4——一種分泌型蛋白
　　目的：闡明PEBP4的結(jié)構(gòu)、功能特點以及在細(xì)胞內(nèi)分布及其分泌能力。
　　方法：采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列比對，PEBP1-4基因以及 mPEBP4與hPEBP4異同及其特點；構(gòu)建C’-/N’-GFP-Myc-PEBP4重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；Western-blotting檢測PEBP4在293T細(xì)胞漿/培養(yǎng)液表達(dá)；激光共聚焦顯微鏡觀察PEBP4在293T細(xì)胞內(nèi)分布之改變。
　　結(jié)果：序

6、列比對發(fā)現(xiàn)：PEBP1-3在基因序列和功能機(jī)制是相似的；而PEBP4則很可能是一個結(jié)構(gòu)特殊的、存在不同功能的蛋白；N’末端融合免疫標(biāo)記物者， PEBP4只能在細(xì)胞漿中檢測；而C’末端融合免疫標(biāo)記物者，則可在細(xì)胞培養(yǎng)液中檢出；當(dāng)C’末端融合GFP，熒光信號呈點狀分布在核周；N’末端融合GFP，顯示熒光信號均勻分別在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。
　　結(jié)論：PEBP4是一個分泌型蛋白；N’末端的完整性對其分泌功能是必須的。
　　第四部分 PEBP4

7、的糖基化
　　目的：確認(rèn)PEBP4的糖基化及其位點。
　　方法：采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列比對，hPEBP4與 mPEBP4有無 N-糖基化共有序列；對PEBP4-R172/-T172A/-E188進(jìn)行基因定點突變，構(gòu)建相應(yīng)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western-blotting檢測突變型/野生型PEBP4之表達(dá)；蛋白質(zhì)組學(xué)、HILIC LC/MS或是LC-MS/MS檢測N-糖基化之改變。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)方法

8、進(jìn)行序列比對：hPEBP4有一個N-糖基化共有序列(N169KT)；mPEBP4則有二個N-糖基化共有序列(N78IS與140IT)；突變型序列分子量小于野生型的，表明突變阻止了N-糖基化；HILIC LC/MS或是LC-MS/MS均可檢出N-糖基化之相應(yīng)改變。
　　結(jié)論：hPEBP4和mPEBP4在N169KT以及N78IS與140IT確實發(fā)生了糖基化。
　　第五部分 PEBP4與 MAPK-ERK/Akt信號通路

9、　　目的：探討PEBP4對MAPK-ERK信號通路以及Akt信號通路的影響。
　　方法：構(gòu)建PEBP4-shRNA質(zhì)粒，下調(diào)PEBP4表達(dá)；Western-blotting檢測：經(jīng)EGF處理后，或是C’-Myc-PEBP4和 N’-Myc-PEBP4分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后， ERK1/2和磷酸化ERK1/2以及Akt和磷酸化Akt的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：用PEBP4-shRNA下調(diào)PEBP4表達(dá)后，經(jīng)EGF處理，ERK1/2和磷酸化

10、ERK1/2的表達(dá)不變；而Akt的表達(dá)不變，但磷酸化Akt的表達(dá)隨著PEBP4下降減少；C’-Myc-PEBP4和 N’-Myc-PEBP4分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，ERK1/2和磷酸化ERK1/2以及Akt和磷酸化Akt的表達(dá)均不變。
　　結(jié)論：PEBP4不參與EGF引起的ERK激活，但參與了Akt相關(guān)信號通路的調(diào)控。
　　第六部分敲除 PEBP4后雌性小鼠代謝的若干改變
　　目的：初步探討PEBP4對能量代謝的影響。