胎鼠卵巢體外培養(yǎng)及電轉(zhuǎn)介導(dǎo)的外源基因在胎鼠卵巢的表達(dá)研究.pdf

1、卵巢是雌性哺乳動(dòng)物重要的生殖器官和內(nèi)分泌腺體，卵巢的功能由其基本結(jié)構(gòu)單位卵泡實(shí)現(xiàn)，而卵泡的發(fā)育依賴于卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的相互作用。在小鼠中原始卵泡的形成起始于胚胎17.5天。為了大規(guī)模篩選哪些基因參與原始卵泡形成，我們建立了胎鼠及新生鼠卵巢體外培養(yǎng)的新方法，在此基礎(chǔ)上利用電轉(zhuǎn)有效實(shí)現(xiàn)了原始卵泡形成相關(guān)基因的功能驗(yàn)證，并且在原始卵泡無(wú)法形成的基因敲除鼠中恢復(fù)了原始卵泡的形成。
　　 首先我們構(gòu)建并優(yōu)化了一種簡(jiǎn)易的胎鼠及新生鼠卵巢體

2、外瓊脂糖培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)用該體系能模擬小鼠卵巢。利用該培養(yǎng)體系，以pcDNA3.0-H2B-GFP和FAM-non-targetingsiRNAs分別作為質(zhì)粒和小RNA電轉(zhuǎn)的marker轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的卵巢，組合不同電轉(zhuǎn)參數(shù)，篩選出了胎鼠及新生鼠卵巢質(zhì)粒和小RNA電轉(zhuǎn)的最優(yōu)電轉(zhuǎn)參數(shù)，分別為27v，10ms，1000msinterval，10pulse和27v，10ms，1000msinterval，5pulse，正反一次電場(chǎng)。在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證了電

3、轉(zhuǎn)系統(tǒng)的安全性，證明電轉(zhuǎn)并不影響卵泡的正常發(fā)育。隨后對(duì)質(zhì)粒和小RNA電轉(zhuǎn)的效率進(jìn)行了確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)卵巢中質(zhì)粒電轉(zhuǎn)效率可達(dá)到約32.80±2.91％，小RNA的電轉(zhuǎn)效率可達(dá)到40％-54％。接下來(lái)對(duì)電轉(zhuǎn)體系基因過(guò)表達(dá)及敲減的效果進(jìn)行了表型驗(yàn)證。對(duì)胚胎18.5天的胎鼠卵巢體外培養(yǎng)并電轉(zhuǎn)pcDNA3.1-GDF9-CyclinD1質(zhì)粒，導(dǎo)致原始卵泡數(shù)目的顯著下降，這與在CyclinD1過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠中觀察到的表型一致，說(shuō)明電轉(zhuǎn)體系可有效介導(dǎo)外源