胎鼠卵巢體外培養(yǎng)及電轉介導的外源基因在胎鼠卵巢的表達研究.pdf

1、卵巢是雌性哺乳動物重要的生殖器官和內分泌腺體，卵巢的功能由其基本結構單位卵泡實現(xiàn)，而卵泡的發(fā)育依賴于卵母細胞及顆粒細胞的相互作用。在小鼠中原始卵泡的形成起始于胚胎17.5天。為了大規(guī)模篩選哪些基因參與原始卵泡形成，我們建立了胎鼠及新生鼠卵巢體外培養(yǎng)的新方法，在此基礎上利用電轉有效實現(xiàn)了原始卵泡形成相關基因的功能驗證，并且在原始卵泡無法形成的基因敲除鼠中恢復了原始卵泡的形成。
　　 首先我們構建并優(yōu)化了一種簡易的胎鼠及新生鼠卵巢體

2、外瓊脂糖培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)用該體系能模擬小鼠卵巢。利用該培養(yǎng)體系，以pcDNA3.0-H2B-GFP和FAM-non-targetingsiRNAs分別作為質粒和小RNA電轉的marker轉染培養(yǎng)的卵巢，組合不同電轉參數(shù)，篩選出了胎鼠及新生鼠卵巢質粒和小RNA電轉的最優(yōu)電轉參數(shù)，分別為27v，10ms，1000msinterval，10pulse和27v，10ms，1000msinterval，5pulse，正反一次電場。在此基礎上驗證了電

3、轉系統(tǒng)的安全性，證明電轉并不影響卵泡的正常發(fā)育。隨后對質粒和小RNA電轉的效率進行了確認，發(fā)現(xiàn)卵巢中質粒電轉效率可達到約32.80±2.91％，小RNA的電轉效率可達到40％-54％。接下來對電轉體系基因過表達及敲減的效果進行了表型驗證。對胚胎18.5天的胎鼠卵巢體外培養(yǎng)并電轉pcDNA3.1-GDF9-CyclinD1質粒，導致原始卵泡數(shù)目的顯著下降，這與在CyclinD1過表達的轉基因鼠中觀察到的表型一致，說明電轉體系可有效介導外源