小鼠胚胎干細(xì)胞在成年小鼠肝微環(huán)境中的腺癌變及其細(xì)胞癌變的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)是由早期胚胎分離出來的全能干細(xì)胞，其在體外可保持分化成為全身各種細(xì)胞和組織的潛能。胚胎干細(xì)胞需要維持一個(gè)正常微環(huán)境，這種環(huán)境利于胚胎干細(xì)胞自行更新與分化間的一個(gè)平衡。在成年小鼠體內(nèi)不同微環(huán)境作用下，來自囊胚的小鼠胚胎干細(xì)胞則可能出現(xiàn)不同的分化方向。在本研究中我們通過將小鼠未分化胚胎干細(xì)胞移植于成年小鼠肝臟微環(huán)境，觀察在肝臟微環(huán)境內(nèi)胚胎干細(xì)胞向癌細(xì)胞分化

2、的可能性，并從體內(nèi)、外兩個(gè)層次分析影響胚胎干細(xì)胞變化的肝臟組織微環(huán)境功能因子及其可能的作用機(jī)制,通過探究成年小鼠體內(nèi)微環(huán)境對胚胎干細(xì)胞分化方向可能存在的影響,以期為腫瘤發(fā)生的研究提供新的思路。
　　目的：
　　1.探究小鼠胚胎干細(xì)胞在成年小鼠肝臟微環(huán)境中可能出現(xiàn)的分化方向以及其是否會(huì)發(fā)生向惡性腫瘤細(xì)胞的分化。
　　2.通過比較肝臟組織與皮下組織內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的差異，分析誘導(dǎo)ESCs腺癌變的肝臟微環(huán)境功能因子，并進(jìn)行體外

3、誘導(dǎo)ESCs腺癌變的功能驗(yàn)證。
　　3.探究胚胎干細(xì)胞向腺癌細(xì)胞分化的過程中，TGF-β1接觸的誘導(dǎo)與Wnt/β-catenin信號通路的相關(guān)性，驗(yàn)證調(diào)控胚胎干細(xì)胞的癌變的下游信號分子。
　　方法：
　　1.小鼠胚胎干細(xì)胞在肝臟微環(huán)境內(nèi)致瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：(1)實(shí)驗(yàn)用小鼠胚胎干細(xì)胞性質(zhì)鑒定：免疫熒光法檢測早期胚胎特異性表面抗原SSEA-1、OCT-4和Nanog表達(dá)以及堿性磷酸酶(AKP)染色；體內(nèi)分化能力檢測其多能性。（

4、2）進(jìn)行胚胎干細(xì)胞小鼠肝臟內(nèi)原位移植（簡稱ESC移植組,ESC組），同時(shí)對比ESC在皮下成瘤后瘤塊移植于肝臟（簡稱瘤塊移植組，Sub-tumor block組）和將肝癌HepG2細(xì)胞直接接種于肝臟（簡稱HepG2移植組, HepG2組）。（3）觀察裸鼠腫瘤移植后成瘤性：核磁掃描、ELISA檢測小鼠血清中的AFP、GP73含量；檢測血清ALT、AST含量；病理組織學(xué)分析；免疫組化檢測瘤組織AFP、Villin、CK20表達(dá)；E-cadhe

5、rin、PCNA、N-cadherin蛋白表達(dá)。
　　2.TGF-β1及HGF誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞瘤化的體外實(shí)驗(yàn)：（1）免疫組化及Western-blot檢測小鼠肝臟組織及皮下組織內(nèi)TGF-β1、HGF表達(dá)。（2）TGF-β1、HGF細(xì)胞因子對ES細(xì)胞的體外誘導(dǎo)；誘導(dǎo)分化的第7-15天分別測量誘導(dǎo)組上清液中AFP、GP73含量；免疫熒光檢測Villin、CK20及OCT4的表達(dá)水平；免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測E-cadherin、PCNA、N

6、-cadherin表達(dá)。（3）進(jìn)行細(xì)胞侵襲能力的檢測。
　　3.TGF-β1作用下Wnt/β-catenin信號通路的檢測和阻斷Wnt/β-catenin信號通路后對誘導(dǎo)作用的驗(yàn)證：（1）正常ESC細(xì)胞以TGF-β1誘導(dǎo)（即ESC組）作為對照組，在TGF-β1誘導(dǎo)前施加外源性Wnt通路抑制劑DKK1處理ESC細(xì)胞（DKK1-ESC），或針對β-catenin干擾腺病毒感染處理ESC細(xì)胞（si-β-catenin-ESC）。(2)檢

7、測誘導(dǎo)后對ESC細(xì)胞體外侵襲的影響；免疫組化檢測TGF-β1誘導(dǎo)后DKK1-ESC和si-β-catenin-ESC細(xì)胞E-Cadherin和N-cadherin及PCNA表達(dá)。（3） RT-PCR檢測WNT1 mRNA的水平；Western-blot檢測Smad2，Smad3， Wnt1蛋白表達(dá)水平；熒光定量PCR檢測各組ESC細(xì)胞β-catenin基因表達(dá)水平；Western-blot檢測β-catenin，p-GSK-3β，GSK

8、-3β蛋白， Cyclin-D1, C-myc蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠胚胎干細(xì)胞在肝臟微環(huán)境內(nèi)致瘤的檢測：（1）ESC集落有其典型的未分化形態(tài)學(xué)特征，AKP染色呈陽性；免疫熒光法檢測早期胚胎特異性表面抗原SSEA-1、OCT-4和Nanog表達(dá)均呈陽性；體內(nèi)分化能力檢測證實(shí)其形成三胚層結(jié)構(gòu)，具有多向分化能力。（2）ESC直接移植組小鼠移植成瘤率明顯低于HepG2陽性對照組，但高于皮下瘤快移植組(P<0．05)

9、；ESC直接移植組瘤體平均體積、平均生長率明顯小于皮下瘤快移植(P<0．05)，但高于HepG2陽性對照組，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。（3）接種ESC組血清ALT、AST在接種后的4周內(nèi)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，并且較皮下瘤移植組均有明顯升高，但較HepG2組血清ALT升高水平明顯減低(P<0.05)；接種ESC組血清AFP、GP73在接種后的4周內(nèi)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，并且較皮下瘤移植組均有明顯升高，但較HepG2組升高水平明顯

10、減低(P<0.05);病理組織學(xué)表明接種ESC組為惡性畸胎瘤伴腺上皮癌變，較皮下瘤塊移植組為成熟畸胎瘤的惡性程度增高，但較HepG2肝癌組降低；AFP在ESC組移植瘤中陽性較皮下瘤移植組增強(qiáng)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但是陽性強(qiáng)度較HepG2組肝癌組織表達(dá)弱；Villin和CK20在ESC組移植瘤中陽性較皮下瘤移植組減弱(P<0.01)，陽性強(qiáng)度較HepG2肝癌組織有明顯增強(qiáng)(P<0.01)；在ESC組移植瘤中E-cadhe

11、rin陽性較皮下瘤移植組減弱(P<0.01)，但陽性強(qiáng)度較HepG2肝癌組織表達(dá)有增高的趨勢。N-cadherin、PCNA在ESC組移植瘤中陽性較皮下瘤移植組增強(qiáng)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但陽性強(qiáng)度較HepG2肝癌組織表達(dá)有減弱。
　　2.TGF-β1及HGF誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞瘤化的檢測：（1）免疫組化及Western-blot結(jié)果表明小鼠肝臟組織及皮下組織內(nèi)TGF-β1蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)陽性，但小鼠肝臟組織的TGF-β1

12、表達(dá)顯著高于皮下組織（P<0.05）。（2）TGF-β1誘導(dǎo)組ES細(xì)胞以貼壁處為中心向四周分化生長，細(xì)胞群落的中心和周邊有類似癌樣細(xì)胞形成,HGF誘導(dǎo)組在15天后也未見癌細(xì)胞樣分化出現(xiàn)。ELISA檢測條件培養(yǎng)基內(nèi)AFP和GP73的濃度變化顯示在誘導(dǎo)組ESC上清液中AFP和GP73較對照組均有明顯升高，其差異具有顯著意義(P<0.01)而 HGF誘導(dǎo)組 AFP未見明顯升高(P>0.05)；免疫熒光染色結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)組Villin

13、和CK20陽性表達(dá)較HGF誘導(dǎo)組和對照組有增強(qiáng),而OCT4表達(dá)明顯減弱；TGF-β1誘導(dǎo)后較HGF誘導(dǎo)組和對照組E-Cadherin表達(dá)減弱但N-cadherin及PCNA染色有增高；（3）進(jìn)行細(xì)胞侵襲能力的檢測顯示TGF-β1誘導(dǎo)后較HGF誘導(dǎo)組和對照組細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)(P<0.01)。
　　3.TGF-β1作用下Wnt/β-catenin信號通路的檢測和阻斷Wnt/β-catenin信號通路后對誘導(dǎo)作用的驗(yàn)證：(1) TGF-β

14、1誘導(dǎo)DKK1-ESC細(xì)胞及si-β-catenin-ESC細(xì)胞，集落形態(tài)已經(jīng)不規(guī)則，細(xì)胞團(tuán)增殖減慢，顏色變深，誘導(dǎo)分化作用不明顯；（2） DKK1-ESC和si-β-catenin-ESC組在經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后其侵襲明顯較對照ESC組降低，其差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示DKK1-ESC細(xì)胞和 si-β-catenin-ESC組經(jīng) TGF-β1誘導(dǎo)后其E-Cadherin表達(dá)較對照ESC組有增高；其N-

15、cadherin及PCNA表達(dá)較對照ESC組有減低(P<0.01)；（3）RT-PCR檢測WNT1 mRNA的水平，顯示TGF-β1誘導(dǎo)促使ES細(xì)胞WNT1 mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)；而DKK1-ESC組在TGF-β1誘導(dǎo)后其WNT1 mRNA表達(dá)較TGF-β1誘導(dǎo)正常ESC有減低趨勢(P<0.05)；si-β-catenin-ESC組在TGF-β1誘導(dǎo)后其WNT1 mRNA表達(dá)較TGF-β1誘導(dǎo)正常ESC組無明顯差異(P>

16、0.05)。Western-blot結(jié)果顯示在各組ES細(xì)胞中Smad2、Smad3、Wnt1蛋白均呈現(xiàn)陽性，TGF-β1誘導(dǎo)促使ES細(xì)胞Smad3、Wnt1增高改變更為明顯(P<0.01)；DKK1-ESC組在TGF-β1誘導(dǎo)后其Wnt1表達(dá)較TGF-β1誘導(dǎo)正常ESC組有減低趨勢(P<0.05)；FQ-RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)促使ES細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá)明顯較正常對照ESC增高(P<0.01)；而DKK1-

17、ESC組和si-β-catenin-ESC組在經(jīng) TGF-β1誘導(dǎo)后其β-catenin mRNA表達(dá)較TGF-β1誘導(dǎo)正常ESC組有減低趨勢(P<0.01)；Western-blot結(jié)果顯示 TGF-β1誘導(dǎo)促使 ES細(xì)胞β-catenin， Cyclin-D1、C-myc增高改變明顯(P<0.01)，而 p-GSK-3β則明顯下調(diào)；但DKK1-ESC組和si-β-catenin-ESC組在經(jīng) TGF-β1誘導(dǎo)后其β-catenin，

18、 Cyclin-D1、 C-myc表達(dá)較TGF-β1誘導(dǎo)正常ESC組有減低趨勢(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.小鼠胚胎干細(xì)胞在成年鼠肝臟微環(huán)境內(nèi)形成肝臟惡性腺上皮癌，小鼠皮下畸胎瘤塊移植于肝臟微環(huán)境后也發(fā)生肝臟腺上皮癌變，表明了胚胎干細(xì)胞在成年小鼠肝臟微環(huán)境誘導(dǎo)下可能發(fā)生向惡性腺上皮細(xì)胞的分化。
　　2.通過將皮下組織與肝臟組織的TGF-β1、HGF因子的差異性分析和TGF-β1、HGF因子體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞腺

19、癌變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，TGF-β1可能是ESCs在成年小鼠肝臟中腺癌變的主要誘導(dǎo)因子之一。
　　3.通過對TGF-β1誘導(dǎo)后ES細(xì)胞Wnt/β-catenin信號相關(guān)分子的檢測，表明了TGF-β1誘導(dǎo)促使ES細(xì)胞發(fā)生癌變的機(jī)制與Wnt/β-catenin上調(diào)、GSK-3β蛋白磷酸化減少，以及Cyclin-D1, C-myc蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)；而通過Wnt信號抑制劑DKK1處理后或者β-catenin干擾腺病毒作用ESC細(xì)胞后，可能將TG