高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及氫氣對(duì)肺的氧化損傷的防治研究.pdf

1、第一部分:高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及機(jī)制研究
　　疼痛是一種復(fù)雜的生理心理活動(dòng)，是臨床上最常見的癥狀之一，并可造成器官功能障礙。劇烈和長期的疼痛會(huì)影響到人體各器官系統(tǒng)的功能，如引起睡眠障礙、消化功能受抑制、血壓升高、心率加快（有心臟病者可致心率失常）、呼吸急促（胸、腹部疼痛時(shí)通氣受限）、植物神經(jīng)功能紊亂、關(guān)節(jié)功能下降和心理障礙等，造成藥物濫用、自殺等社會(huì)問題。如何進(jìn)行安全、有效的鎮(zhèn)痛，對(duì)減輕病人痛苦、提高患者生活質(zhì)量具有重大意義。雖然高壓

2、氧(HBO)尚未用于臨床鎮(zhèn)痛，但已有多個(gè)臨床觀察發(fā)現(xiàn)HBO的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，包括對(duì)復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合征、纖維肌痛、慢性骨髓炎、偏頭痛和叢集性頭痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)等。本課題重點(diǎn)研究高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及機(jī)制。
　　在本研究的第一部分，發(fā)現(xiàn)單次的HBO處理可產(chǎn)生急性鎮(zhèn)痛作用，且鎮(zhèn)痛效果和氧氣的壓力之間存在顯著的線性關(guān)系。進(jìn)一步研究單次HBO處理誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)的時(shí)程特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在暴露后即刻、10 min、30 min、60 min和90 min后，高

3、壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)都可以保持在80％左右。120分鐘后下降到50％以下，在180分鐘時(shí)下降到20％左右。更有意義的是，給予小鼠每天1個(gè)小時(shí)的HBO處理，連續(xù)給予4次后，可以誘導(dǎo)獨(dú)特的雙相鎮(zhèn)痛效應(yīng):(1)早期鎮(zhèn)痛:HBO處理后1小時(shí)后出現(xiàn)，持續(xù)約8小時(shí);(2)晚期鎮(zhèn)痛:早期鎮(zhèn)痛1天后開始出現(xiàn)，持續(xù)時(shí)間長達(dá)近3周。
　　在研究的第二部分，重點(diǎn)研究了NOS在高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)中的作用。首先，在HBO暴露結(jié)束后分別給予小鼠非特異性NOS抑制劑、

4、nNOS抑制劑、eNOS抑制劑和iNOS抑制劑，然后觀察它們對(duì)單次高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非特異性NOS抑制劑和nNOS抑制劑都顯著抑制了高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。另外，單次給予非特異性NOS抑制劑和nNOS抑制劑都顯著抑制了反復(fù)HBO處理誘導(dǎo)的早期鎮(zhèn)痛效應(yīng)，而持續(xù)給予非特異性NOS抑制劑和nNOS抑制劑顯著抑制了反復(fù)HBO處理誘導(dǎo)的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)。此外，發(fā)現(xiàn)HBO暴露1小時(shí)后，皮層、腦干和脊髓中的NO含量顯著增高。而當(dāng)小鼠反復(fù)HBO暴

5、露后休息7天后，在各個(gè)腦組織內(nèi)，高壓氧氣暴露組的NO含量無顯著變化。最后，Western blot結(jié)果顯示，小鼠暴露于高壓氧氣后，小腦、腦干和脊髓的nNOS的含量顯著增高。
　　在研究的第三部分，重點(diǎn)研究nNOS、GABA受體和5-HT1A受體在其中的作用。首先研究了GABA受體拮抗劑對(duì)單次HBO處理引起的鎮(zhèn)痛作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射GABAA受體拮抗劑引起鎮(zhèn)痛效應(yīng)的劑量相關(guān)性降低，而側(cè)腦室注射GABAB受體抑制劑對(duì)單次H

6、BO處理引起的鎮(zhèn)痛作用幾乎沒有影響。對(duì)于反復(fù)HBO處理，末次HBO處理3小時(shí)后進(jìn)行側(cè)腦室注射GABAA受體抑制劑和GABAB受體抑制劑，其對(duì)HBO處理誘導(dǎo)的早、晚期鎮(zhèn)痛作用無顯著影響，而在末次HBO處理7天后進(jìn)行側(cè)腦室注射GABAB受體抑制劑，則引起了高壓氧的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)的顯著下降，說明:(1) GABAA受體可能參與了單次HBO暴露誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng);(2)GABAA受體和GABAB受體可能都沒有參與反復(fù)HBO暴露誘導(dǎo)的早期鎮(zhèn)痛效應(yīng);(3

7、)GABAB受體可能參與了反復(fù)HBO暴露誘導(dǎo)的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)。此外，我們?cè)趩未蜨BO處理結(jié)束3小時(shí)后側(cè)腦室注射5-HT1A受體阻斷劑，發(fā)現(xiàn)其對(duì)單次HBO處理導(dǎo)致的鎮(zhèn)痛效應(yīng)沒有影響。5-HT1A受體阻斷劑對(duì)反復(fù)HBO處理導(dǎo)致的早期鎮(zhèn)痛效應(yīng)也沒有顯著影響，但在HBO處理結(jié)束7天后側(cè)腦室注射5-HT1A受體阻斷劑，其對(duì)反復(fù)HBO處理導(dǎo)致的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)有顯著的抑制作用。這些結(jié)果說明，5-HT1A受體沒有參與單次HBO誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用和反復(fù)HBO誘導(dǎo)

8、的早期鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但很可能參與了反復(fù)HBO誘導(dǎo)的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)。此外，在PAG中，我們沒有觀察到nNOS+神經(jīng)元和5-HT1A受體陽性神經(jīng)元有重合，但是觀察到nNOS+神經(jīng)元和GAD+神經(jīng)元出現(xiàn)重合，表明nNOS和GAD之間可能直接存在互相作用。
　　綜上所述，本研究證明，單次高壓氧導(dǎo)致的急性鎮(zhèn)痛效應(yīng)的機(jī)制涉及到nNOS和GABAA受體的激活，雙相鎮(zhèn)痛效應(yīng)的早期效應(yīng)的機(jī)制涉及到nNOS的激活，而晚期效應(yīng)的機(jī)制涉及到發(fā)生在PAG中的nN

9、OS與GABAB受體的相互作用以及5-HT1A受體的參與。和其他鎮(zhèn)痛藥物方式相比，高壓氧有著不可替代的優(yōu)勢(shì)，費(fèi)用較為低廉，無成癮性、耐受性好，具有巨大的臨床利用價(jià)值。本課題證實(shí)了高壓氧的短效和長效鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并從中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制探索其效應(yīng)，為高壓氧的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究首次選用HBO-nNOS-GABA-5-HT1A信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)作為高壓氧鎮(zhèn)痛的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行研究，借此研究可能形成一個(gè)完整的思路探索高壓氧的中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制，找出其鎮(zhèn)痛機(jī)制的關(guān)

10、鍵靶點(diǎn)，為開發(fā)鎮(zhèn)痛藥物提供新的策略。
　　第二部分:氫氣對(duì)肺的氧化損傷的保護(hù)效應(yīng)研究
　　肺的氧化損傷是一種很常見的病理過程。很多因素，如過度吸氧、大氣污染、吸煙、放射、重金屬離子等等都可以造成肺的氧化損傷。需要長期吸氧的病人，一方面需要吸氧，一方面又面臨著肺的氧化損傷的危險(xiǎn)。這對(duì)矛盾常常難以解決，導(dǎo)致病人最后呼吸衰竭而死。另外，近來研究證明，大氣污染和吸煙使肺組織直接暴露在有害因素中，引起肺臟嚴(yán)重的氧化損傷。放射引起的機(jī)體

11、損傷也主要是氧化損傷，并且60％-70％的損傷是由羥自由基引起的。一些重金屬離子如鎘、鉻和汞等也可以引起肺的氧化損傷。肺的氧化損傷非常常見，因此，如果能找到一種安全、有效的藥物來防治肺的氧化損傷，對(duì)人類健康具有重大意義。
　　在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，氫氣的應(yīng)用長久以來僅限于呼吸氫氧混合氣進(jìn)行大深度潛水，一般認(rèn)為它不會(huì)和體內(nèi)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。1975年，Malcolm Dole等人首次報(bào)道，高壓氫氣（8 ATA）可能可以通過清除羥自由基治療癌癥。

12、2001年，Bouchra Gharib等人發(fā)現(xiàn)高壓氫氣(8 ATA)有對(duì)抗寄生蟲引起的肝炎作用，其機(jī)制也和清除羥自由基有關(guān)。但如此高壓的氫氣在臨床上難以應(yīng)用，因此他們的研究并沒有引起廣泛的關(guān)注。直到2007年，Ikuroh Ohsawa等人首次發(fā)現(xiàn)，普通壓力的氫氣也能發(fā)揮抗氧化作用，并且其機(jī)制為選擇性清除毒性氧自由基，氫氣的抗氧化作用才得以被廣泛關(guān)注。隨后，有人又證明呼吸2％的氫氣可治療肝和心肌缺血再灌注損傷、小腸移植引起的炎癥損傷、

13、新生兒腦缺血缺氧損傷等。此外，飲用飽和氫氣水可治療應(yīng)激引起的神經(jīng)損傷、人類Ⅱ型糖尿病、化療藥順鉑引起的腎損傷和帕金森病，改善新生兒腦缺血缺氧損傷后神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶能力等等。這些研究表明，氫氣能夠減輕氧化損傷。
　　肺的氧化損傷的機(jī)理還不是很清楚，但是有很多研究表明它和超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基密切相關(guān)。既然氫氣可以通過選擇性清除氧自由基發(fā)揮抗氧化作用，那么它對(duì)肺的氧化損傷有沒有療效呢？我們教研室的前期研究證明氫氣可以減輕高壓

14、氧導(dǎo)致的成年大鼠的肺損傷。但是，高壓氧只是眾多造成肺的氧化損傷的因素的一種，且這種因素并不常見。因此，我們通過構(gòu)建從動(dòng)物到細(xì)胞的兩種不同的肺的氧化損傷模型，通過不同方式給予氫氣處理，來觀察它對(duì)肺的氧化損傷的效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)第一部分，采用腹腔注射百草枯造成大鼠肺的氧化損傷模型，并通過口服給予大鼠飽和含氫水治療。百草枯進(jìn)入機(jī)體后主要聚集于肺部，經(jīng)過單電子還原形成自由基，然后與分子氧反應(yīng)生成聯(lián)吡啶陽離子和超氧陰離子，后者歧化形成H2O2

15、，再在Fe2+存在下形成羥自由基，引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細(xì)胞膜，使膜受體、膜蛋白酶和離子通道的脂質(zhì)微環(huán)境改變，引起肺組織的氧化損傷。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，口服給予飽和含氫水顯著減少大鼠的胸腔積液、肺濕干比重、支氣管肺泡灌洗液中的蛋白質(zhì)含量和總細(xì)胞計(jì)數(shù)、乳酸脫氫酶，以及肺組織中的MDA含量。蘇木精伊紅(H&E)和TUNEL染色顯示氫水組的肺組織損傷和細(xì)胞凋亡顯著減輕。所有這些結(jié)果表明，口服含氫水可以抑制肺的氧化損傷，改善百草枯中毒引起的肺生化

16、和組織學(xué)改變。
　　實(shí)驗(yàn)第二部分，用H2O2造成更具代表性的氧化損傷，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究氫氣能否減輕Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的氧化損傷。給予細(xì)胞H2O2處理后，細(xì)胞的死亡率顯著上升，氧化損傷產(chǎn)物MDA和8-OHdG明顯升高，細(xì)胞的抗氧化酶SOD和GSH水平顯著降低，顯示細(xì)胞的抗氧化能力下降。而給予氫氣處理后，氫氣可以有效降低A549細(xì)胞受到氧化損傷后的壞死率，有效抑制A549細(xì)胞氧化損傷后MDA、8-OHdG的升高和SOD、GSH的下降。所