梅毒血清固定患者的治療及其外周血單個(gè)核細(xì)胞microRNAs表達(dá)譜的研究.pdf

1、背景和目的:梅毒血清固定是指部分患者經(jīng)過正規(guī)驅(qū)梅方案治療后，其快速血漿血清反應(yīng)素（Rapid plasma region test，RPR）滴度下降至一定水平后不再變化并長期維持低滴度，即稱為血清固定。在臨床工作中，我們經(jīng)常會(huì)給予梅毒血清固定患者經(jīng)驗(yàn)性的芐星青霉素治療。然而，關(guān)于芐星青霉素對(duì)梅毒血清固定患者療效的系統(tǒng)研究相對(duì)較少。此外，梅毒血清固定的發(fā)病機(jī)制一直不清楚，有學(xué)者認(rèn)為與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，其中microRNA可能發(fā)揮著重要

2、的調(diào)節(jié)作用。MicroRNA是一類長度約為21bp的非編碼負(fù)性調(diào)控RNA分子，參與眾多重要生理和病理途徑，包括炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)、凋亡、并在宿主抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮不可替代的調(diào)節(jié)作用。病原體能夠利用microRNA進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以利于微生物在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和免疫逃逸。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)microRNA在結(jié)核分枝桿菌、幽門螺旋桿菌等感染性疾病的發(fā)生和進(jìn)展過程中扮演著重要的角色，但是有關(guān)梅毒螺旋體的研究尚屬空白。
　　因此本課

3、題首先從臨床角度探討芐星青霉素治療梅毒血清固定患者的療效。其次，從功能基因組學(xué)角度出發(fā)，運(yùn)用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)二期梅毒和梅毒血清固定患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）microRNA進(jìn)行研究，篩選鑒定出特異表達(dá)microRNA，并通過生物信息學(xué)技術(shù)研究其與靶基因及相關(guān)調(diào)控途徑，為揭示梅毒血清固定的發(fā)病機(jī)制提供有價(jià)值的研究思路。
　　研究對(duì)象:
　　1.

4、療效評(píng)價(jià):從2001年1月-2013年1月期間我院皮膚性病中心有病歷記載的697例晚期潛伏梅毒和971例不明病期潛伏梅毒患者中，選擇有完整隨訪記錄的70例梅毒血清固定患者資料進(jìn)行回顧性分析，其中芐星青霉素復(fù)治組的患者35例，無任何治療組患者35例。兩組平均年齡均為30歲，性別比例無顯著性差異。
　　2.microRNA表達(dá)譜的研究:選取2013年6月-2014年6月期間就診于我院皮膚性病中心并經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)確診的28例二期梅毒、27

5、例梅毒血清固定患者。同期收集40例健康志愿者作為對(duì)照組。三組間性別、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　方法:
　　1.回顧性分析我院性病中心2001年1月-2013年1月期間的有完整隨訪記錄的70例梅毒血清固定患者，將其分為芐星青霉素治療組(n=35)和對(duì)照組(n=35)。治療組患者予芐星青霉素240萬單位肌注，每周1次，一共3次進(jìn)行復(fù)治。對(duì)照組患者未予任何治療。復(fù)治12個(gè)月后復(fù)查RPR滴度以觀療效。以RPR下降≥2個(gè)滴度為有效，RP

6、R下降＜2個(gè)滴度為無效判定結(jié)果。
　　2.選取2013年6月-2014年6月期間在我院皮膚科性病中心診斷的二期梅毒、血清固定患者各5例，并收集5例健康志愿者作為對(duì)照組，采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)Illumina HiSeq法對(duì)15例患者的PBMC樣本進(jìn)行microRNA深度測(cè)序研究，分析差異性表達(dá)的基因，擴(kuò)大樣本量，收集23例二期梅毒患者、22例梅毒血清固定患者和35例健康志愿者PBMC樣本，對(duì)顯著差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)

7、熒光定量PCR(Real time-PCR，RT-PCR)驗(yàn)證。利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、Gene Ontology(GO)和KEGG功能注釋等分析。
　　結(jié)果:
　　1.芐星青霉素治療組中有26例患者治療有效，9例患者治療無效，仍保持血清固定，有效率為74.2％;無任何治療的對(duì)照組中有28例患者治療有效，7例患者治療無效，有效率為80％，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.所有15個(gè)樣品均建庫成功

8、，并采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序。二期梅毒、血清固定患者和正常對(duì)照組三組間所測(cè)的microRNAs表達(dá)水平兩兩對(duì)比后，(1)以Ratio＞1和P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)二期梅毒與正常對(duì)照組間表達(dá)差異表達(dá)的microRNAs有146個(gè)，其中54個(gè)上調(diào)，92個(gè)下調(diào);血清固定組與正常對(duì)照組間表達(dá)差異表達(dá)microRNAs有111個(gè)，其中61個(gè)上調(diào)，50個(gè)下調(diào);血清固定組與二期梅毒患者組間表達(dá)差異microRNAs有142個(gè)

9、，其中88個(gè)上調(diào)，54個(gè)下調(diào)。(2)以Ratio≥2和P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)二期梅毒與正常對(duì)照組間表達(dá)差異表達(dá)的microRNAs有58個(gè)，其中33個(gè)上調(diào)，25個(gè)下調(diào);血清固定組與正常對(duì)照組間表達(dá)差異表達(dá)microRNAs有53個(gè)，其中40個(gè)上調(diào)，13個(gè)下調(diào);血清固定組與二期梅毒患者組間表達(dá)差異microRNAs有49個(gè)，其中32個(gè)上調(diào)，17個(gè)下調(diào)。同時(shí)預(yù)測(cè)得到新的microRNA數(shù)目為657種。
　　3.擴(kuò)大樣本量，收

10、集23例二期梅毒、22例梅毒血清固定患者和35例健康志愿的PBMC標(biāo)本，選擇測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)顯著的13種microRNA，對(duì)miR-299-3p、miR-451a、miR-548j-3p、miR-654-5p、miR-3135b、miR-338-5p、Novel-5、Novel-62、Novel-73、Novel-124、Novel-128、Novel-163和Novel-244行RT-PCR分析后發(fā)現(xiàn)Novel-128和Novel-

11、244在二期梅毒和梅毒固定患者PBMC中表達(dá)均降低，Novel-163只在二期梅毒中降低，而Novel-5表達(dá)升高，miR-338-5p只在梅毒血清固定患者中(表達(dá))升高。
　　(根)據(jù)GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示二期梅毒與血清固定患者差異表達(dá)的microRNA預(yù)測(cè)調(diào)控的靶基因顯著性功能包含許多種，涉及到代謝（糖、蛋白質(zhì)修飾）、生長（細(xì)胞增殖及增殖中的正、負(fù)調(diào)控、細(xì)胞周期、細(xì)胞周期阻滯）、分化、凋亡（細(xì)胞凋亡、抗凋亡、誘導(dǎo)凋亡、

12、凋亡抑制）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面功能;同時(shí)，這些靶基因涉及的通路途徑包括:代謝途徑（固醇類生物合成、糖原合成途徑、脂肪酸合成、嘌呤、嘧啶合成途徑）、細(xì)胞生長途徑（細(xì)胞周期）、連接途徑（黏附連接、緊密連接）等，細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附等。
　　5.Novel-224與miR-338-5p呈正相關(guān)，Novel-5與Novel-128、miR-338-5p和Novel-163均呈正相關(guān)，提示microRNA之間也存在一定表達(dá)或功能相關(guān)性。

13、　　結(jié)論:
　　1.我們用芐星青霉素復(fù)治晚期潛伏梅毒和不明病期潛伏梅毒的血清固定患者，治療組的35例患者中有26例有效，而未復(fù)治的對(duì)照組中也有28例患者出現(xiàn)RPR滴度的下降，兩組療效統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，故其有效性還有待進(jìn)一步觀察，同時(shí)結(jié)果顯示梅毒血清固定患者RPR滴度可隨著時(shí)間的延長而逐漸降低。
　　2.梅毒血清固定患者外周血單個(gè)核細(xì)胞具有特異的microRNA表達(dá)譜。miR-338-5p、Novel-163、Novel-128