RARα和NLS-RARα蛋白的細(xì)胞生物學(xué)功能分析及其作為轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁(yè)
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1、第一部分?jǐn)y帶RARα基因的重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)人白血病細(xì)胞的影響
  目的:用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建人RARα基因重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒,感染人白血病細(xì)胞株NB4后用一定濃度的全反式維甲酸ATRA誘導(dǎo),觀察其對(duì)白血病細(xì)胞株增殖、分化和凋亡的影響,同時(shí)與變異型NLS-RARα的細(xì)胞生物學(xué)功能相比較,觀察二者的生物學(xué)功能差異。
  方法:以白血病細(xì)胞株NB4的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增RARα基因,克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTra

2、ce-TO4中,構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TO4-RARα。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR V和Sal I雙酶切及測(cè)序鑒定,然后轉(zhuǎn)化含有骨架質(zhì)粒AdEasy-1的大腸桿菌BJ5183菌株的感受態(tài),同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒Ad-RARα。酶切驗(yàn)證后,限制性?xún)?nèi)切酶Pac I酶線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,包裝出重組腺病毒Ad-RARα,經(jīng)3輪擴(kuò)增后,測(cè)定病毒滴度,進(jìn)行PCR鑒定。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定病毒感染效率,Western blot法

3、檢測(cè)重組腺病毒感染的人NB4細(xì)胞中RARα蛋白,CCK-8法檢測(cè)重組腺病毒感染對(duì)NB4細(xì)胞增殖的影響,Annexin V/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞周期,PI測(cè)定細(xì)胞凋亡,Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)。
  結(jié)果:重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TO4-RARα構(gòu)建成功,病毒感染效率可達(dá)70%,與對(duì)照組的NB4細(xì)胞相比,重組腺病毒感染的NB4細(xì)胞內(nèi)RARα蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05),且經(jīng)一

4、定濃度全反式維甲酸ATRA處理后,能夠有效地促進(jìn)感染重組腺病毒細(xì)胞的分化成熟和凋亡,變異蛋白NLS-RARα與之相比,NLS-RARα亦能促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖,抑制分化。
  結(jié)論:變異蛋白NLS-RARα與野生型RARα在白血病細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)后均能促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞分化,在經(jīng)一定濃度的維甲酸誘導(dǎo)后均能促進(jìn)細(xì)胞分化成熟和凋亡,故得出結(jié)論:變異蛋白NLS-RARα與野生型RARα的細(xì)胞生物學(xué)功能相似,NLS-RARα可能通過(guò)與野生

5、型RARα類(lèi)似的功能影響白血病細(xì)胞株的細(xì)胞生物學(xué)功能。
  第二部分RARα和NLS-RARα的結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究
  目的:通過(guò)研究NLS-RARα的結(jié)合位點(diǎn),與RARα的結(jié)合位點(diǎn)相比較,證明NLS-RARα為一個(gè)變異的轉(zhuǎn)錄因子,可能與RARα競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合某些基因而參與到APL的發(fā)生中。
  方法:構(gòu)建維甲酸受體α(RARα)、視黃醛受體α(RXRα)及變異蛋白NLS-RARα的真核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)間接免疫熒光(I

6、FF)觀察 RARα、RXRα和 NLS-RARα的核漿分布,然后用免疫共沉淀(Co-IP)分別檢測(cè)RARα、NLS-RARα同RXRα是否有相互作用;凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)RARα、NLS-RARα結(jié)合維甲酸反應(yīng)元件DNA探針的能力;最后用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RARα和NLS-RARα調(diào)控維甲酸反應(yīng)元件活性的程度。
  結(jié)果:維甲酸受體α(RARα)、視黃醛受體α(RXRα)的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;間接免疫熒光結(jié)果顯

7、示,與 RARα相比, NLS-RARα更多地分布在細(xì)胞核內(nèi);免疫共沉淀和 Native-PAGE結(jié)果顯示NLS-RARα與RXRα有相互作用,并能夠形成二聚體;凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明NLS-RARα能夠結(jié)合維甲酸反應(yīng)元件DNA探針及調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。
  結(jié)論:該研究成功地構(gòu)建了RARα、RXRα的真核表達(dá)質(zhì)粒,并證明NLS-RARα有轉(zhuǎn)錄活性,NLS-RARα可能作為一個(gè)變異的轉(zhuǎn)錄因子參與影響白血病細(xì)胞株的增殖

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