芥子氣脂肪蓄積新發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、芥子氣(Sulfur Mustard，SM)是一種具有強烷基化能力的起皰劑，可快速透過皮膚、眼睛和肺支氣管粘膜等途徑進入生物體內(nèi)與多種生命物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。由于其制備簡單、殺傷力大，在戰(zhàn)爭中被廣泛使用。當(dāng)前，日本二戰(zhàn)后遺棄在華的大量化學(xué)武器，其中以SM為主，仍在威脅中國人民的生命和財產(chǎn)安全。隨著近年來國際極端民族主義和宗教主義的死灰復(fù)燃，SM被用于恐怖襲擊和不對稱戰(zhàn)爭的可能性日益增大，因此繼續(xù)對SM損傷機理和防治手段的研究仍有重要的現(xiàn)實意義

2、。
　　自首次合成至今，對SM的毒理機制研究已持續(xù)了一個多世紀，科學(xué)家對SM損傷機制提出了很多假說，但其明確機理仍然未知。由于芥子氣具有親脂性，暴露后會迅速透過機體表面屏障，侵入機體組織和循環(huán)系統(tǒng)，可與DNA、蛋白質(zhì)等絕大多數(shù)生物分子發(fā)生廣泛烷基化反應(yīng)。這些分子的烷基化會影響DNA的合成與修復(fù)，干擾酶活和細胞代謝，最終導(dǎo)致細胞凋亡、機體炎癥、免疫反應(yīng)和代謝紊亂的發(fā)生。同時SM損傷存在潛伏期，其癥狀在暴露數(shù)小時后才會出現(xiàn)，且癥狀反復(fù)

3、多樣，目前尚無SM損傷的特效治療方案。因此SM仍是一種難防難治的化學(xué)戰(zhàn)劑。
　　本課題組前期研究建立的SM原型的衍生化液-質(zhì)聯(lián)用檢測方法，針對SM原型在大鼠組織中的分布進行研究，結(jié)果提示脂肪組織中SM原型存在高水平持續(xù)留存，發(fā)現(xiàn)了SM脂肪蓄積的新現(xiàn)象并進行了驗證。同時通過SM-DNA加合物同時定量檢測方法的建立，本課題組對SM-DNA加合物在大鼠組織中的分布進行了研究，發(fā)現(xiàn)脂肪含量高的組織中，如骨髓和腦，其SM-DNA加合物含量也

4、較高，且SM-DNA加合物在脂肪組織中可較長時間持續(xù)存在，提示親脂環(huán)境對加合物形成可能具有顯著影響。
　　基于實驗室前期的研究結(jié)果，本論文通過體外染毒后脂肪細胞在DNA加合物形成、存活率和細胞損傷評價，以及大鼠染毒后脂肪組織脂體系數(shù)、病理損傷評價，對SM脂肪蓄積的毒性效應(yīng)進行了研究;通過染毒后大鼠脂源因子mRNA水平和蛋白水平評價，初步探討了SM脂肪蓄積的生物學(xué)意義。全文共分為五章。
　　第一章是前言。該部分對SM在理化性質(zhì)

5、、歷史、損傷機制方面的研究進展進行了介紹，并對近年來脂肪組織功能和脂源因子研究的成果進行了評述。提出了本論文的研究目的、研究內(nèi)容和創(chuàng)新點。
　　第二章是體外染毒模型的建立。通過分離大鼠原代前脂肪細胞，對脂肪細胞分化條件進行了優(yōu)化;通過培養(yǎng)人皮下前脂肪細胞（Human Preadipocytessubcultaneous，HPA-s），成功獲得高分化率(80％)的成熟脂肪細胞(HumanAdipocytes subcultaneou

6、s，HA-s);并成功培養(yǎng)傳代三種SM主要損傷組織的人源化細胞包括人永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT)、人肺纖維細胞(HLF)、正常人類肝細胞(L-02)，作為對照細胞，為SM脂肪蓄積研究體外染毒實驗提供細胞模型。同時通過CCK-8方法檢測包括成熟脂肪細胞在內(nèi)五種細胞的SM染毒IC50，結(jié)果顯示HA-s細胞的SM染毒IC50(484.3±22.7μM)遠高于其它四種細胞(HaCaT77.5±5.5μM、HLF69.9±4.3μM、L-02

7、73.8±3.7μM、HPA-s62.5±0.4μM)，初步說明脂肪細胞對SM染毒具有抵抗能力。
　　第三章是體外染毒SM-DNA加合物檢測?；谝呀⒌腢PLC-MS/MS方法，進行了方法學(xué)驗證。結(jié)果表明該方法對從體外染毒細胞中提取SM-DNA加合物的檢測，具有較好的選擇性、檢測線性、準確度、精密度和穩(wěn)定性，其定量限低(N7-HETEG為0.02 ng/mL、Bis-G為0.05 ng/mL、N3-HETEA為0.1 ng/mL

8、)，基質(zhì)效應(yīng)小，回收率高，樣品穩(wěn)定性也較好。各項參數(shù)均符合驗證要求。確定其可被用于體外染毒細胞SM-DNA加合物的同時定量檢測。通過對包括成熟脂肪細胞在內(nèi)的五種細胞進行體外染毒SM-DNA加合物的量時關(guān)系進行檢測，對包括成熟脂肪細胞在內(nèi)的不同染毒細胞SM-DNA加合物形成差異進行了研究。結(jié)果表明SM-DNA單取代加合物形成速度高于雙取代加合物，而三種加合物的相對含量依次為:N7-HETEG＞Bis-G＞N3-HETEA;不同細胞SM-D

9、NA加合物形成的峰值差異較小，但成熟脂肪細胞雙取代加合物占比更高(＞33％)，在SM-DNA加合物達峰時間和清除速度上也低于其它組織來源細胞。從而在體外水平證實了SM脂肪蓄積現(xiàn)象和脂肪細胞對SM染毒的抵抗能力。
　　第四章是SM體外染毒對細胞功能的影響。通過高內(nèi)涵分析，從細胞核和細胞形態(tài)、溶酶體、線粒體、氧化應(yīng)激和DNA損傷方面對HPA-s和HA-s在SM染毒后細胞損傷與染毒劑量和染毒時間的變化趨勢進行研究。結(jié)果顯示SM染毒造成了

10、細胞損傷，其程度與染毒劑量和染毒時間成依賴關(guān)系;染毒HA-s在溶酶體、線粒體、氧化應(yīng)激和DNA損傷方面細胞毒性指標隨染毒劑量和時間變化的速度和水平均低于HPA-s。從細胞毒性參數(shù)角度揭示了成熟脂肪細胞對SM染毒損傷抵抗能力。同時選擇HA-s和HLF染毒上清與HaCaT、HLF和L-02染毒細胞共培養(yǎng)，通過CCK-8方法對染毒上清共培養(yǎng)細胞的活性進行檢測，研究HA-s和HLF染毒上清對其它細胞活性的影響。結(jié)果表明HLF細胞染毒上清會提高其

11、它細胞體外染毒IC50值;而HA-s細胞染毒上清則會降低其它細胞體外染毒IC50值，同時降低程度與HA-s的染毒劑量成依賴關(guān)系。提示了脂源因子對其它細胞的生長抑制作用及脂肪蓄積SM的繼發(fā)毒性，以及清除脂肪細胞中的SM對降低機體繼發(fā)損傷的重要性。
　　第五章是SM染毒對大鼠脂肪組織功能的影響。通過大鼠染毒模型，獲得染毒大鼠體重和脂體系數(shù)變化趨勢數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示脂肪組織在機體染毒應(yīng)激反應(yīng)過程中被劇烈消耗，提示了脂肪中蓄積的SM隨組織劇烈

12、消耗而再次釋放的可能。
　　通過病理切片，評價了皮下、腎周、附睪和褐色脂肪組織的病理損傷情況。結(jié)果顯示脂肪組織暴露損傷主要體現(xiàn)為血管擴張，和血管周圍炎癥細胞浸潤，對成熟脂肪細胞的損傷則并不明顯。從體內(nèi)水平驗證了成熟脂肪細胞對SM染毒的抵抗能力。
　　通過RT-qPCR和定量ELISA，對大鼠皮下脂肪組織中各脂源因子水平進行檢測。結(jié)果顯示SM染毒會導(dǎo)致促炎因子上調(diào)、抑炎因子下調(diào)，脂肪細胞分化因子和能量代謝因子的分泌也受到影響。