基于PLGA膜與Necl-1蛋白構(gòu)建體外組織工程化神經(jīng)的研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 Necl-1蛋白對(duì)雪旺細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　背景:目前周圍神經(jīng)缺損的治療效果尚不十分理想，研究組織工程神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損得到許多關(guān)注，常用的種子細(xì)胞是雪旺細(xì)胞(SCs)，但是現(xiàn)存的問題是其與支架材料的粘附力不足，影響了組織工程化神經(jīng)的構(gòu)建及其效果。如增加細(xì)胞與載體之間的粘附力，提高載體上的細(xì)胞數(shù)量，有望改善其效果。
　　目的:研究Necl-1蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的SCs的影

2、響，觀察SCs的生物學(xué)特性，主要考察其對(duì)SCs增殖、粘附和形態(tài)維持作用及GDNF、BDNF和CNTF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響。
　　方法:使用RSC96雪旺細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，擴(kuò)增培養(yǎng)備用， MTT法測(cè)定不同濃度的Necl-1對(duì)SCs的影響，篩選出三個(gè)較佳濃度(25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)。用篩出來的三個(gè)較佳濃度的Necl-1進(jìn)一步干預(yù)SCs，不加Necl-1為對(duì)照，分別于2d、4d和6d，通過檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞活

3、力FDA/PI熒光染色，蘇木精-伊紅染色，S-100b免疫組化測(cè)定及細(xì)胞RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)GDNF、BDNF、CNTF、S-100b基因表達(dá)量，進(jìn)一步考察Necl-1對(duì)SCs的促進(jìn)作用。
　　結(jié)果:MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)Necl-1濃度為50μg/ml時(shí)，其對(duì)SCs的增殖促進(jìn)作用最明顯，濃度為250μg/ml后開始出現(xiàn)抑制作用。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Necl-1各組在2d、4d、6

4、d時(shí)所測(cè)MTT值均較對(duì)照組要高。細(xì)胞的FDA/PI熒光染色中Necl-1各組與空白對(duì)照組死活細(xì)胞比例差別不大。HE染色的結(jié)果顯示各組細(xì)胞形態(tài)上并沒有差異，但Necl-1各組在細(xì)胞密度方面較空白對(duì)照組大，且在濃度50μg/ml時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)Necl-1在濃度為50μg/ml時(shí)，分別在第4d、6d天的OD值相對(duì)較高。通過對(duì)SCs的S-100b免疫組化進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)Necl-1各組的SCs中S-100b陽性表達(dá)較對(duì)空白對(duì)照組相比有明顯增加，且

5、50μg/ml濃度的Necl-1培養(yǎng)SCs，其S-100b表達(dá)量最大。在基因表達(dá)方面，發(fā)現(xiàn)Necl-1各組中GDNF、BDNF、CNTF、S-100b的表達(dá)量較對(duì)照組均有顯著上調(diào)。SCs在Necl-1濃度為50μg/ml下培養(yǎng)4d、6d時(shí)其CNTF、GDNF、S-100b的表達(dá)能力最強(qiáng)。而BDNF在2d時(shí)各組表達(dá)差異不大，但在4d時(shí)濃度為25μg/ml表現(xiàn)較為明顯的促進(jìn)作用，6d則為50μg/ml有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論:實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的Necl-1能促進(jìn)SCs增殖和粘附，并能維持其細(xì)胞形態(tài)，增強(qiáng)GDNF、BDNF和CNTF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，為SCs參與外周神經(jīng)修復(fù)提供一個(gè)更為適宜的微環(huán)境。提示Necl-1為制備更為穩(wěn)定的組織工程神經(jīng)提供可能。
　　第二部分 基于PLGA和Necl-1蛋白構(gòu)建體外組織工程化神經(jīng)
　　背景:聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是由乳酸和羥基乙酸兩

7、種單體隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，因此是一種廣泛應(yīng)用的組織工程神經(jīng)支架?；赑LGA膜材料并結(jié)合Necl-1蛋白構(gòu)建組織工程化神經(jīng)，考察Necl-1對(duì)SCs的增殖粘附作用以及特異的錨定作用，探索制備組織工程神經(jīng)的新思路。
　　目的:通過蛋白因子結(jié)合組織工程技術(shù)，為周圍神經(jīng)修復(fù)提供新模型，檢測(cè)SCs的相關(guān)生物學(xué)特性，探究SCs經(jīng)Necl-1蛋白干預(yù)后在PLGA

8、膜材料上的增殖及粘附情況。
　　方法:將PLGA膜材料表層均勻涂上Necl-1蛋白，使其Necl-1化。在PLGA膜上種植SCs，在不同組間分別加入較佳濃度的Necl-1蛋白（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）進(jìn)行試驗(yàn)。分別于2d、4d和6d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定MTT細(xì)胞增殖量，考察PLGA膜聯(lián)合Necl-1蛋白對(duì)SCs的增殖粘附作用的影響;通過FDA/PI，H&E染色觀察不同濃度下SCs形態(tài)特性的變化;通過S-100b

9、免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)SCs特異蛋白的表達(dá)水平。采用RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因GDNF、BDNF、CNTF、S-100b的表達(dá)。運(yùn)用電子顯微鏡(SEM)觀察細(xì)胞在PLGA膜上生長情況及形態(tài)特征。
　　結(jié)果:SCs能較好地粘附于PLGA膜材料上生長。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在2、4、6d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上Necl-1各組均較空白對(duì)照組結(jié)果要好，尤其以N2（50μg/ml）濃度為最佳。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示各組的OD值均較同期的無PLGA膜要高，其中N1

10、、N2在4d、6d時(shí)間點(diǎn)上對(duì)細(xì)胞的增殖作用表現(xiàn)較好。通過H&E染色觀察可知其細(xì)胞形態(tài)并沒有改變，Necl-1各組細(xì)胞在4、6d時(shí)成簇生長明顯。 FDA/PI熒光染色檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果表明死活細(xì)胞比例方面空白組與藥物組差別不大。免疫組化方面，N2（50μg/ml）濃度下SCs的S-100b表達(dá)量相對(duì)較高。對(duì)于Necl-1組基因表達(dá)的情況，實(shí)驗(yàn)得出無論GDNF、BDNF、CNTF、S-100b，其表達(dá)水平均大于空白對(duì)照組，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長

11、其表達(dá)水平均有顯著上升，其中仍以N2（50μg/ml）濃度最強(qiáng)。掃描電子顯微鏡(SEM)的結(jié)果顯示PLGA二維支架接種SCs2d、4d和6d后，細(xì)胞能較穩(wěn)定的粘附在支架表面鋪展生長，部分細(xì)胞可向膜內(nèi)嵌入生長。隨著時(shí)間的延長，粘附在支架上的細(xì)胞數(shù)量明顯增加。同時(shí)間點(diǎn)的N2（50μg/ml）組與空白對(duì)照組相比，N2組的細(xì)胞量明顯高于空白對(duì)照組，且N2組細(xì)胞表面有大量突觸形成。
　　結(jié)論:結(jié)合Necl-1蛋白體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)更為穩(wěn)