ANKRD18B基因在肺癌和大腸癌中的甲基化與表達分析.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　肺癌與大腸癌是常見的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，在世界范圍內(nèi)腫瘤性疾病中，肺癌與大腸癌發(fā)病率及死亡率分別排在第一位及第三位，嚴重威脅人類健康。隨著對腫瘤發(fā)生的分子機制的研究，尋找有效的分子生物學(xué)標志物對腫瘤高危人群開展早期篩選，對于降低肺癌及大腸癌的發(fā)生率及死亡率，改善患者的生活質(zhì)量有著重要意義。本課題組前期通過對腫瘤發(fā)生過程中異常甲基化改變進行全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)ANKRD18B基因(Ankyrin repeat domai

2、n18B)在肺癌及大腸癌發(fā)生過程中明顯高甲基化，提示該基因異常甲基化可能與肺癌及大腸癌發(fā)生有關(guān)。同時，通過文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)該基因異常甲基化和表達調(diào)控等在肺癌及大腸癌中的相關(guān)報道，因此具有較大的研究價值。
　　根據(jù)前期的實驗結(jié)果，我們推測ANKRD18B基因在腫瘤發(fā)生過程中通過高甲基化而失活，可能是一個候選的抑癌基因，因此有必要進一步擴大樣本證實該基因在肺癌及大腸癌中甲基化的變化情況以及與臨床病理的關(guān)系，同時對該基因在腫瘤發(fā)生過程中

3、的作用和功能進行初步研究。為進一步研究該基因在生長發(fā)育、疾病發(fā)生、信號通路等方面的作用提供理論基礎(chǔ)。
　　實驗方法:
　　1.采用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)方法分析肺癌組織及正常組織、肺癌患者血漿及痰液中ANKRD18B基因高甲基化的發(fā)生情況;對臨床資料完整的配對大腸癌患者癌組織及癌旁正常組織采用MSP方法分析ANKRD18B基因甲基化的變化情況;
　　2.利用MSP

4、方法，分析了來源于不同組織腫瘤細胞株和正常細胞中ANKRD18B基因甲基化情況;
　　3.采用RT-PCR對去甲基化藥物5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-dC)處理前后的腫瘤細胞中ANKRD18B基因的表達情況進行分析，評價ANKRD18B基因甲基化對其表達調(diào)控的影響;
　　4.構(gòu)建ANKRD18B基因高表達細胞模型，采用細胞克隆形成實驗等方法，對該基因在腫瘤發(fā)生過程中的功能進行初步研究。
　　實驗結(jié)果:
　

5、　1.采用MSP方法分析了ANKRD18B基因在98例肺癌組織和20例正常組織中的高甲基化發(fā)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):53.1％(52/98)腫瘤組織中該基因高甲基化，而20例正常組織中均未檢測到該基因高甲基化(0％，0/20)(P＜0.01)。
　　2.應(yīng)用MSP方法分析了來源于肺癌病人的65例痰液標本和85例血漿標本中ANKRD18B基因甲基化發(fā)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):36.9％(24/65)血漿標本和38.8％(33/85)的痰標本中能夠

6、檢測出該基因的高甲基化。
　　3.對病理資料完整的62例肺癌組織ANKRD18B基因甲基化與臨床病理關(guān)系進行分析發(fā)現(xiàn):該基因甲基化與年齡、性別以及腫瘤類型等沒有明顯的相關(guān)性(P＞0.05);但在吸煙病人腫瘤組織和早期腫瘤組織中該基因甲基化有一定增加，而且腫瘤細胞分化程度越低，該基因甲基化發(fā)生率越高(P=0.009)。
　　4.對41例大腸癌組織及20例對應(yīng)癌旁正常組織采用甲基化特異性PCR(MSP)法進行了ANKRD18B基

7、因甲基化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在20例癌旁正常組織中ANKRD18B基因均未發(fā)生甲基化(0％，0/20)，而在41例大腸癌組織中，該基因甲基化發(fā)生率為59％(24/41)(P＜0.01)。
　　5.在肺癌細胞株A549、SPC-A-1、95D、H1975、H358、H1650、LTEP、H1395、H446和H460中高甲基化分析表明，ANKRD18B甲基化發(fā)生率為90％(9/10)，僅有H1650中未發(fā)生甲基化情況，而在正常HBE細胞

8、中未檢測到該基因高甲基化發(fā)生。同時在大腸癌HT-29和SW480細胞中該基因也發(fā)生了高甲基化。
　　6.在不同肺癌細胞株中采用RT-PCR及熒光定量PCR方法檢測該基因甲基化與其表達調(diào)控的關(guān)系。結(jié)果表明:該基因高甲基化的肺癌細胞中其表達明顯下調(diào)，而正常支氣管上皮細胞HBE表達較高。為了進一步證實該基因表達下調(diào)是由于其高甲基化導(dǎo)致的，對部分細胞采用去甲基化藥物5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-dC)去甲基化處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANKR

9、D18B基因高甲基化細胞經(jīng)去甲基化處理后，其表達明顯上調(diào)，表明該基因甲基化直接調(diào)控其表達。由于該基因在腫瘤發(fā)生中明顯高甲基化失活，提示其可能是一個候選的抑癌基因。
　　7.以H358細胞為基礎(chǔ)，成功建立了該基因高表達細胞模型。通過細胞克隆形成實驗分析，發(fā)現(xiàn)該基因高表達后，能夠明顯抑制腫瘤細胞的生長和腫瘤細胞克隆形成。實驗初步證明ANKRD18B基因具有抑癌作用。
　　結(jié)論:
　　1.ANKRD18B基因在肺癌組織、大腸