新型DNA折紙芯片系統(tǒng)的開發(fā)與研究.pdf

1、DNA納米技術(shù)是一門新興的交叉學(xué)科，是指利用DNA自組裝構(gòu)建各種一維、二維、或三維的結(jié)構(gòu)，并開發(fā)其應(yīng)用。DNA納米技術(shù)從80年代中期Seeman開創(chuàng)至今，已經(jīng)經(jīng)歷了長(zhǎng)足發(fā)展。國內(nèi)目前系統(tǒng)介紹該領(lǐng)域的論文或?qū)Ｖ鴺O少，所以本論文的目的之一就是對(duì)其研究進(jìn)展做出最新最全的綜述，希望能對(duì)國內(nèi)的研究者有所幫助，推動(dòng)該領(lǐng)域在國內(nèi)的發(fā)展。因?yàn)槭墙徊鎸W(xué)科，論文涉及到生物、化學(xué)、物理、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)、納米技術(shù)等知識(shí)內(nèi)容，相信任何相關(guān)領(lǐng)域的科研工作者都可以在此

2、找到用武之地。
　　 DNA納米技術(shù)包括tile自組裝、DNA折紙術(shù)、及DNA納米器件三個(gè)大的方向，本文受篇幅所限只涉及前兩個(gè)分支。除此之外，本文還分析了DNA參與納米技術(shù)領(lǐng)域的種種優(yōu)勢(shì)，并詳述了DNA納米技術(shù)的一項(xiàng)重要應(yīng)用-DNA納米排布。
　　 本課題的內(nèi)容是開發(fā)一種新型的DNA折紙芯片，這其實(shí)也屬于納米排布的一種。所謂DNA折紙芯片，就是由DNA折紙術(shù)得到的圖形改造為的芯片。2008年初，美國亞利桑那大學(xué)的Ke等研

3、制出了第一張、也是此前唯一一張折紙芯片。他們把折紙圖形上的訂書釘鏈伸出V字型探針，然后與溶液中的目標(biāo)RNA雜交，通過雜交前后AFM圖像的亮度差實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該芯片的優(yōu)點(diǎn)是目標(biāo)鏈不用標(biāo)記，檢測(cè)較靈敏，但缺點(diǎn)是存在位置效應(yīng)（折紙圖形各位置的探針雜交效率有明顯差異），且可擴(kuò)展性不強(qiáng)。我們的目的就是用新的策略制成折紙芯片，希望在盡量保持Ke等原有優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，改善其不足。
　　 我們的核心思路是把V字型探針改為最常用的“一字型”探針，并引入b

4、iotin-STV反應(yīng)來增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度。具體的做法是在折紙圖形特定位置的訂書釘鏈末端伸出寡核苷酸探針，讓它與末端修飾biotin的目標(biāo)鏈一對(duì)一雜交，雜交后加入STV蛋白使得雜交位點(diǎn)在AFM下呈現(xiàn)明顯亮點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。另外我們還把Ke等的折紙矩形換為折紙術(shù)中國地圖，這是為了增加探針的可尋址性。
　　 我們先用預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了biotin-STV反應(yīng)的可行性，然后在正式試驗(yàn)中用8個(gè)探針對(duì)一個(gè)32-mer目標(biāo)鏈檢測(cè)，從AFM的圖上可以看出

5、，亮點(diǎn)非常特異，效率較高，與設(shè)計(jì)完全相同。實(shí)驗(yàn)的成功證明了方案的可行，接下來，我們就著手考察本折紙芯片的特性，特別是Ke等芯片中的不足之處。
　　 我們共分析了兩種效應(yīng)的影響：位置效應(yīng)和biotin方向效應(yīng)。我們先把上面使用過的8個(gè)探針分為兩組，一組位于圖形邊界，一組位于中央，然后觀察兩組的檢測(cè)效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組并無差異，這說明本芯片無位置效應(yīng)。我們又把同樣的8個(gè)探針分為另外兩組，一組是訂書釘鏈3’端延伸探針，此時(shí)雜交后biot

6、in將朝下，另一組5’延伸，雜交后biotin朝上，也觀察兩組效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3’組比5’組效率高，我們推測(cè)主要是3’的成像效果更好，于是以后都推薦用3’延伸。
　　 我們還進(jìn)一步設(shè)計(jì)了兩個(gè)更深入的實(shí)驗(yàn)。第一個(gè)是多重檢測(cè)，即考察一張芯片同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)鏈檢測(cè)的分辨能力。我們同時(shí)在地圖的兩個(gè)位置分別伸出一列32-mer和一列20-mer的探針，然后分別加入對(duì)應(yīng)的目標(biāo)鏈，觀察圖形是否在特異的位置產(chǎn)生亮點(diǎn)。結(jié)果顯示特異性很好。第二個(gè)是夾心

7、法實(shí)驗(yàn)，這是一種新的雜交策略，即用capture probe來固定目標(biāo)鏈，用reporter probe來釋放雜交信號(hào)。這種設(shè)計(jì)的好處要么是折紙芯片本身的通用性，要么是目標(biāo)鏈的label-free性，取決于capture探針是否設(shè)計(jì)為通用。
　　 除此之外，我們還做了若干延伸實(shí)驗(yàn)。對(duì)納米金和量子點(diǎn)的排布有一些好的結(jié)果，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證；修飾i-motif的實(shí)驗(yàn)則沒有很好的證據(jù)顯示分子馬達(dá)的工作狀態(tài)。這里特別要說的是利用本折紙芯片

8、對(duì)SNP的檢測(cè)，我們又設(shè)計(jì)了一種雜交方式，引入了toehold的鏈競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，目前已實(shí)現(xiàn)對(duì)兩個(gè)連續(xù)堿基差異的檢測(cè)。進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中，本系統(tǒng)有望實(shí)現(xiàn)完全label-free、且可重用的折紙芯片。
　　 總之，本研究開發(fā)了一種新型的DNA折紙芯片，它與之前已有的折紙芯片相比，不用做索引標(biāo)記、沒有位置效應(yīng)、具備很強(qiáng)的擴(kuò)展?jié)摿?。本研究不僅對(duì)本折紙芯片的特性做了較系統(tǒng)的考察，還設(shè)計(jì)了另外兩種非常有意義的雜交方式，大大推動(dòng)了本折紙芯

9、片向?qū)嵱妙I(lǐng)域的發(fā)展。
　　 本文第三章對(duì)DNA納米技術(shù)將來的幾個(gè)發(fā)展方向做了展望，分別提出了自組裝構(gòu)圖、功能化納米排布、內(nèi)在機(jī)制、實(shí)用性四個(gè)分支所可能取得突破的一些研究課題。
　　 本文最后還以附章的形式介紹了本人在研究生階段所進(jìn)行的另一項(xiàng)工作：關(guān)聯(lián)分析。研究集中在G72與COMT兩個(gè)基因與雙相情感障礙(BP)疾病的關(guān)聯(lián)上，最后分別在兩個(gè)基因中各找到一個(gè)與BP呈陽性關(guān)聯(lián)的SNP，rs778293和rs4680，暗示了兩個(gè)