新型雙融合分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL基因治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種主要累及關(guān)節(jié)的慢性自身免疫性疾病，由于自身免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致活動關(guān)節(jié)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和滑膜增生，引起關(guān)節(jié)軟骨和骨的侵蝕和破壞。RA的病因不明，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有許多致病環(huán)節(jié)和因素相互作用，促炎性細(xì)胞因子TNF-α和自身反應(yīng)性T細(xì)胞被認(rèn)為在RA發(fā)病機(jī)制中起了很重要的作用。其中，炎性細(xì)胞因子TNF-α在RA關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)高表達(dá)，能促使滑膜細(xì)胞分泌多種炎性細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)并能夠明顯促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖，造成組織損傷，

2、因此，抑制TNF-α的促炎作用對于有效治療RA至關(guān)重要;浸潤在RA患者關(guān)節(jié)腔和滑膜組織中的炎性細(xì)胞以CD4+T細(xì)胞為主，在RA病程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，因此拮抗T細(xì)胞是治療RA的一種有效策略。
　　近年來，TNF拮抗劑逐漸應(yīng)用于RA臨床治療，其中蛋白治療藥物Etanercept（依那西普，商品名Enbrel）（p75TNFR-Fc融合蛋白）在臨床上獲得了很好的療效，但是依然有一部分患者對此種治療沒有效果或者效果不明顯，亟需更有效并改進(jìn)

3、的替代療法?；谟卸喾N致病因素參與RA的發(fā)生發(fā)展，發(fā)病機(jī)制具有復(fù)雜性，單一因素的拮抗很難達(dá)到理想的治療效果，聯(lián)合阻斷不同致病因素已成為很有吸引力的治療策略。有研究表明，針對T細(xì)胞和TNF的聯(lián)合阻斷，可能比TNF的單獨(dú)阻斷能夠取得更理想的RA治療效果。有研究證明，TNF拮抗劑與T細(xì)胞拮抗劑聯(lián)合應(yīng)用，能夠顯著增強(qiáng)TNF拮抗劑對RA實(shí)驗(yàn)動物模型的治療效果。因此，應(yīng)用TNF拮抗劑和T細(xì)胞拮抗劑聯(lián)合治療RA的策略具有廣闊的發(fā)展前景。
　　基

4、因治療是指將外源治療性基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償由于基因缺陷或異常而引起的疾病，從而達(dá)到治療的目的。即通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源治療性基因轉(zhuǎn)入病人的受體細(xì)胞中，使外源治療性基因發(fā)揮有效作用而治療疾病?；诨蛑委煹膬?yōu)勢特點(diǎn)，并且RA是一種局部關(guān)節(jié)受累的自身免疫性疾病，因此本研究擬采用局部基因治療方法進(jìn)行RA聯(lián)合治療的相關(guān)研究。在基因遞送載體的選擇上，腺相關(guān)病毒(AAV)載體具有免疫原性低，轉(zhuǎn)染效率高，能夠介導(dǎo)目的基因長期表達(dá)等特點(diǎn)，研究發(fā)

5、現(xiàn)AAV有十幾種血清型，其中AAV2是目前常用的穩(wěn)定應(yīng)用于臨床治療的血清型，在國內(nèi)包裝和純化技術(shù)成熟，因此，我們借助于AAV2載體進(jìn)行RA的基因治療研究。
　　RA治療最重要的方式就是誘導(dǎo)免疫耐受，抑制T細(xì)胞的激活。本課題組前期成功構(gòu)建了AAV2介導(dǎo)的CTLA4-FasL融合分子，其中，CTLA4功能域能夠競爭性結(jié)合B7，阻斷T細(xì)胞激活的共刺激信號，誘導(dǎo)耐受;FasL功能域能夠誘導(dǎo)活化T細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡，從而通過抑制激活

6、和誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮對T細(xì)胞的雙重抑制作用。在本課題前期研究中，我們證明腺相關(guān)病毒(AAV)載體介導(dǎo)的CTLA4-FasL基因能夠有效抑制大鼠佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎，并且能夠顯著減少大鼠關(guān)節(jié)中自身反應(yīng)性T細(xì)胞浸潤，抑制滑膜增生，并進(jìn)一步證明CTLA4-FasL融合分子比單獨(dú)FasL分子能更有效地控制大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。
　　基于上述研究背景，本課題研究的目的是選取拮抗TNF的融合基因TNFR-Fc和拮抗T細(xì)胞的融合基因CTLA4-FasL，構(gòu)建

7、腺相關(guān)病毒載體AAV2介導(dǎo)的TNFR-Fc和CTLA4-FasL融合分子，并創(chuàng)新性地在兩組融合基因之間引入自剪切多肽furin和2A，能夠介導(dǎo)上下游融合基因在同一載體、同一開放閱讀框(ORF)中同時、均衡、獨(dú)立表達(dá)，并對兩組融合基因協(xié)同抑制大鼠佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(AIA)的炎癥反應(yīng)及相關(guān)免疫學(xué)作用機(jī)制進(jìn)行深入的探討。
　　首先，我們將TNFR-Fc融合基因克隆入AAV2載體上，構(gòu)建成AAV2.TNFR-Fc（命名為TRFC）重組質(zhì)粒

8、，驗(yàn)證重組質(zhì)粒在體外細(xì)胞模型中獲得分泌性表達(dá)，并對TNFR-Fc目的蛋白中和rat TNFα的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定。隨后，我們將furin裂解位點(diǎn)和2A自剪切序列通過4輪overlap PCR克隆入課題組前期構(gòu)建的CTLA4-FasL融合基因，構(gòu)建成furin-2A-CTLA4-FasL融合基因，將此融合基因通過相應(yīng)酶切位點(diǎn)克隆入TRFC重組質(zhì)粒中，從而構(gòu)建成我們最終所需的AAV2介導(dǎo)的雙融合分子TNFR-Fc(furin-2A)CTLA

9、4-FasL重組質(zhì)粒（命名為TFCF）;接下來將測序正確的重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，收獲的無血清上清經(jīng)WesternBlot和ELISA進(jìn)行檢測，驗(yàn)證重組質(zhì)粒TFCF在體外細(xì)胞模型中獲得平行獨(dú)立共表達(dá)。最后，我們將AAV2介導(dǎo)的雙融合分子重組質(zhì)粒進(jìn)行病毒包裝，應(yīng)用局部基因治療的方式，將包裝后的重組病毒注射到佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(AIA)大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，從免疫后第11天發(fā)病起，觀察重組病毒協(xié)同抑制大鼠關(guān)節(jié)炎的臨床形態(tài)學(xué)和組織學(xué)指標(biāo)

10、，并通過免疫組化，炎性細(xì)胞因子檢測，實(shí)時定量PCR，脾臟活性檢測等進(jìn)行相關(guān)分子機(jī)制研究。
　　研究結(jié)果表明，(1)成功構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pAAV2/TNFR-Fc，驗(yàn)證TNFR-Fc融合基因在體外細(xì)胞模型中獲得分泌性表達(dá)，并證明TNFR-Fc目的蛋白具有中和大鼠TNFα介導(dǎo)的對L929細(xì)胞的殺傷活性;(2)將furin裂解位點(diǎn)和2A自剪切序列融合入CTLA4-FasL基因中，并克隆入TRFC重組質(zhì)粒中，構(gòu)建成pAAV2/T

11、NFR-Fc(furin2A) CTLA4-FasL重組質(zhì)粒（命名為TFCF），并驗(yàn)證TFCF重組質(zhì)粒在體外細(xì)胞模型中獲得兩組融合基因的平行獨(dú)立共表達(dá);(3)接下來觀察雙融合分子重組病毒在實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi)的表達(dá)和治療作用，結(jié)果表明，furin和2A自剪切多肽在AAV.TFCF病毒上發(fā)揮了有效的切割作用，使上下游基因在關(guān)節(jié)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了平行獨(dú)立、均衡共表達(dá);(4)通過觀察踝關(guān)節(jié)指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹厚度等臨床形態(tài)學(xué)指標(biāo)，以及HE染色和番紅O固綠等組織學(xué)指標(biāo)

12、結(jié)果表明，雙融合分子比單融合分子能夠更有效降低大鼠關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腫脹程度，抑制炎癥反應(yīng)和滑膜增生;(5)我們對雙融合分子治療RA相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了研究和探討，通過炎性細(xì)胞因子檢測，證明雙融合分子能夠明顯促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子分泌，抑制促炎細(xì)胞因子水平，從而控制炎癥的持續(xù)發(fā)展;通過免疫組化檢測關(guān)節(jié)內(nèi)CD4基因和TNFα基因水平，證明雙融合分子組在抑制炎性細(xì)胞包括自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的浸潤方面，要顯著優(yōu)于其他兩個單融合分子組，并且能夠更有效下調(diào)

13、關(guān)節(jié)內(nèi)TNFα蛋白水平;流式檢測引流淋巴結(jié)中CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞結(jié)果表明，雙融合分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL聯(lián)合抑制大鼠關(guān)節(jié)炎的作用，部分地取決于上調(diào)引流淋巴結(jié)中CD4+CD25+FoxP3+ Treg細(xì)胞水平相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制;同時通過脾細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明，與單融合分子相比，雙融合分子能夠顯著抑制脾細(xì)胞的增殖率，改善脾腫大的癥狀，并且能夠抑制與RA病情密切相關(guān)的信號分子NO的產(chǎn)生。
　　本研究

14、構(gòu)建了一種新型表達(dá)系統(tǒng)，采用AAV2基因遞送載體，創(chuàng)新性地引入furin和2A自剪切多肽，成功構(gòu)建了新型雙融合分子pAAV2/TNFR-Fc(furin2A)CTLA4-FasL，能夠同時獨(dú)立表達(dá)兩種抗炎蛋白TNFR-Fc和CTLA4-FasL，從體內(nèi)細(xì)胞與分子機(jī)制研究入手，通過各種形態(tài)學(xué)和組織學(xué)等臨床觀察指標(biāo)，以及ELISA檢測細(xì)胞因子水平等相關(guān)檢測，充分證明這種新型雙融合分子的協(xié)同抗炎效應(yīng)，從而提出CTLA4-FasL聯(lián)合TNF抑制