干細(xì)胞源性纖維軟骨自組裝基體的構(gòu)建及力學(xué)性能研究.pdf

1、類似于關(guān)節(jié)軟骨，關(guān)節(jié)盤缺損后難以自我修復(fù)。目前常規(guī)的手術(shù)治療可造成病人的持續(xù)性疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙，因此未來功能性顳下頜關(guān)節(jié)盤置換的發(fā)展是非常必要的。功能性修復(fù)關(guān)節(jié)盤組織因為組織工程技術(shù)的成熟發(fā)展而有了新的希望。在組織工程中，種子細(xì)胞—作為其理論中的三要素之一，對關(guān)節(jié)盤組織再生有著重要的影響。限于關(guān)節(jié)盤細(xì)胞高度分化性、體外培養(yǎng)迅速脫分化失去軟骨表型等特點，直接利用關(guān)節(jié)盤細(xì)胞對缺損組織進(jìn)行修復(fù)面臨著細(xì)胞來源稀缺的難題。近年，間充質(zhì)干細(xì)胞的持

2、續(xù)深入研究，啟發(fā)了研究者對關(guān)節(jié)盤組織工程種子細(xì)胞來源的新思路?；诟杉?xì)胞的多向分化性，研究者試圖通過物理學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)等因素實現(xiàn)對干細(xì)胞的誘導(dǎo)并應(yīng)用于組織工程中。本次研究主要通過生長因子定向誘導(dǎo)及與山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞直接共培養(yǎng)兩種方法誘導(dǎo)并構(gòu)建自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞纖維軟骨基體，同時改善并提高干細(xì)胞源性基體的力學(xué)性能，為成功構(gòu)建干細(xì)胞源性關(guān)節(jié)盤組織用于臨床修復(fù)打下基礎(chǔ)。本研究證明了直接共培養(yǎng)體系與生長因子定向誘導(dǎo)干細(xì)胞源性基體具

3、有相似的力學(xué)性能，這為后期改善工程化關(guān)節(jié)盤的性能提供參考依據(jù)。內(nèi)容分為以下三個部分：
　　第一部分、percoll密度梯度離心法和全骨髓培養(yǎng)法對山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定比較
　　目的：比較percoll密度梯度離心法和全骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度并評估其生物學(xué)特性，為后期實驗摸清實驗條件并提供大量細(xì)胞源。
　　方法：無菌收取3-5月齡山羊股骨骨髓組織，分別采用percoll密度梯度離心法

4、和全骨髓培養(yǎng)法體外分離gBMSCs，相差顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài)；取生長良好的P3代細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長曲線；成纖維細(xì)胞集落形成單位實驗檢測其自我更新能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)。
　　結(jié)果：兩組中原代及傳代細(xì)胞均呈漩渦狀排列生長，兩種分離方法獲得的P3代細(xì)胞“S”形生長曲線形態(tài)相似，全骨髓培養(yǎng)法分離的細(xì)胞在成纖維細(xì)胞集落形成能力中表現(xiàn)出更高的自我更新能力，流式結(jié)果顯示兩者表面標(biāo)志表達(dá)相似，其中CD34、CD44均呈陽性表

5、達(dá)，而CD45呈陰性。
　　結(jié)論：不論密度梯度離心法還是全骨髓培養(yǎng)法，均可得到形態(tài)均一、具有自我更新潛力的gBMSCs。但原代培養(yǎng)過程中密度梯度離心法提取的細(xì)胞增殖速度慢，到第3代時除細(xì)胞自我更新能力外其余細(xì)胞生物學(xué)特性無明顯差異。
　　第二部分、TGF-β1、BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)對自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞纖維軟骨基體的影響
　　目的：誘導(dǎo)并構(gòu)建自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞纖維軟骨基體，觀察其生物學(xué)特征并檢測力學(xué)性能，期

6、望進(jìn)一步探索新的途徑用于顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程的成功構(gòu)建。
　　方法：分離、培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，RT-qPCR檢測軟骨相關(guān)基因表達(dá)水平；按5.5×106/井接種到預(yù)制瓊脂糖井內(nèi)，每日更換誘導(dǎo)液（10ng/mlTGF-β1,500ng/ml BMP-2,10-7M DEX,1×ITS,50mg/l ascorbic acid,40μg/ml proline,100μg/ml pyruvic acid,100U/ml penici

7、llin/100mg/ml streptomycin）培養(yǎng)至42d；于14d、28d、42d時觀察和檢測自組裝gBMSCs纖維軟骨基體形態(tài)、成分變化及基體抗壓縮力學(xué)性能。
　　結(jié)果：經(jīng)過14d誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)組 RT-qPCR檢測軟骨相關(guān)基因（ColⅠ、ColⅡ、ColⅩ、SOX9、GAG）的相對表達(dá)量顯著高于對照組（P<0.01）。與之相反，oct-4表達(dá)水平在誘導(dǎo)組下降至對照組的19％（P<0.01）。與對照組相比，14d、28d

8、、42d時誘導(dǎo)組的組織學(xué)染色均顯示陽性，顯示基體分泌ECM糖胺多糖，14d、28d、42d時誘導(dǎo)組的Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽性，顯示經(jīng)誘導(dǎo)后基體可產(chǎn)生作為原生自然關(guān)節(jié)盤組織的主要成分Ⅰ型膠原。壓縮實驗顯示對照組基體的壓縮模量均小于相應(yīng)時間點誘導(dǎo)組基體的壓縮模量（P<0.05）；對于誘導(dǎo)組，42d時基體壓縮模量最大。
　　結(jié)論：自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞纖維軟骨基體經(jīng)生長因子誘導(dǎo)成功構(gòu)建；基體經(jīng)誘導(dǎo)后分泌的ECM與自然關(guān)節(jié)盤相似

9、，體外培養(yǎng)42d時壓縮模量最大。
　　第三部分、干細(xì)胞源性自組裝顳下頜關(guān)節(jié)盤復(fù)合基體的力學(xué)性能研究
　　目的:改善并提高干細(xì)胞源性自組裝基體的力學(xué)性能，為成功構(gòu)建干細(xì)胞源性關(guān)節(jié)盤組織用于臨床修復(fù)提供細(xì)胞組成篩選及力學(xué)參數(shù)。
　　方法：分別構(gòu)建干細(xì)胞源性自組裝基體誘導(dǎo)組（10ng/mlTGF-β1,500ng/ml BMP-2,10-7M DEX,1×ITS,50mg/l ascorbic acid,40μg/ml pr

10、oline,100μg/ml pyruvic acid,100U/ml penicillin/100mg/ml streptomycin）和共培養(yǎng)組（gBMSCs：TMJ disc cells=2:1），體外培養(yǎng)42d后，觀察和檢測自組裝gBMSCs纖維軟骨基體形態(tài)、成分變化、基體剖面形貌及基體抗壓縮力學(xué)性能。
　　結(jié)果：體視顯微鏡鏡下觀察結(jié)果顯示除陰性對照組，其余各組基體呈類似規(guī)則球體，表面光滑連續(xù)，具有光澤感且輕觸有回彈；除陰

11、性對照組，其余各組組織學(xué)與免疫組織化學(xué)染色都成陽性，其中誘導(dǎo)組著色最深。說明各組自組裝基體可以分泌GAG及Ⅰ型膠原，且誘導(dǎo)組GAG和型膠原含量較共培養(yǎng)組高。掃描電鏡結(jié)果顯示自組裝基體相鄰細(xì)胞突觸接觸，細(xì)胞呈規(guī)則有序?qū)盈B排列，其中誘導(dǎo)組可見密集大量纖維同向排列呈一定走向，細(xì)胞多為層狀重疊分布；共培養(yǎng)組多為層狀細(xì)胞排列，但仍可見短而細(xì)的纖維分布。力學(xué)實驗結(jié)果顯示兩組抗壓縮性能均高于關(guān)節(jié)盤自組裝基體對照組（P<0.05），且誘導(dǎo)組抗壓縮性能明