iTRAQ聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選慢性氟中毒大鼠骨組織差異蛋白及生物信息學(xué)分析.pdf

1、目的：采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較不同劑量氟中毒大鼠及對照組大鼠骨組織的蛋白表達(dá)差異，獲得氟中毒大鼠骨組織中差異表達(dá)蛋白。通過生物信息學(xué)分析鑒定這些差異表達(dá)蛋白，并分析蛋白相互作用及可能參與的信號通路，為揭示氟骨癥發(fā)生的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:1.慢性氟中毒大鼠模型的建立與驗(yàn)證：48只健康SD大鼠隨機(jī)分為4組，對照組飲用自來水,低氟組、中氟組、高氟組分別飲用含50、150、250 mg/L氟化鈉的自來水。飼養(yǎng)6

2、個(gè)月后，檢測氟斑牙發(fā)生率，氟離子選擇電極法檢測各組大鼠尿氟、骨氟、牙氟、血清氟含量；取大鼠股骨干骺端進(jìn)行石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色、光鏡觀察，骨組織形態(tài)學(xué)計(jì)量染氟大鼠骨組織形態(tài)學(xué)改變；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血清骨代謝標(biāo)志物含量。2.采用iTRAQ聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選差異蛋白：提取四組大鼠骨勻漿蛋白酶解為肽段，以iTRAQ試劑標(biāo)記，經(jīng)過強(qiáng)陽離子SCX交換，反相液相色譜分離，質(zhì)譜鑒定和蛋白檢索后得到差異蛋白；對差異蛋白進(jìn)行GO

3、分析、KEGG pathway分析、STRING分析等生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，尋找差異蛋白顯著相關(guān)的生物學(xué)功能，參與的代謝通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，分析蛋白-蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)；篩選出關(guān)鍵蛋白MMP8（基質(zhì)金屬蛋白酶）、CRT（鈣網(wǎng)織蛋白）。3.免疫組織化學(xué)染色法驗(yàn)證MMP8、CRT的表達(dá)：取大鼠骨組織石蠟切片，免疫組化超敏二步法染色觀察MMP8、CRT在股骨組織中的表達(dá)，IPP軟件測定平均光密度驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.慢性氟中

4、毒大鼠模型建立及驗(yàn)證:（1）氟斑牙發(fā)生情況與氟負(fù)荷量的變化：各染氟組大鼠氟斑牙檢出率、尿氟、骨氟和血清氟含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而且隨染氟劑量增高，氟斑牙嚴(yán)重程度、尿氟、骨氟、牙氟和血氟呈上升趨勢。（2）大鼠股骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果：中、高氟組大鼠的骨皮質(zhì)厚度均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低氟組骨小梁平均面積小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低中高氟組成骨細(xì)胞數(shù)均低于對照組，差異有

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。BGP、BALP、PⅠNP檢測結(jié)果：低氟組與對照組比較呈下降趨勢，BALP有顯著差異（P <0.01)，中、高氟組BGP、BALP含量小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；CTX-Ⅰ、TRACP-5b檢測結(jié)果：低中、高氟組TRACP-5b含量均小于對照組，中、高氟組CTX-Ⅰ小于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。2.鑒定到顯著性差異蛋白質(zhì)63個(gè)：（1）相對于正常組，低氟組差異蛋白共

6、13個(gè)，中氟組差異蛋白共35個(gè)，高氟組差異蛋白共33個(gè)；（2）差異蛋白參與的生物學(xué)過程有37種、細(xì)胞組分有39種、分子功能有40種；（3）參與的相關(guān)信號通路15條。（4）差異蛋白質(zhì)內(nèi)部構(gòu)建了基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，51個(gè)蛋白質(zhì)的基因都有直接或間接的聯(lián)系。3.免疫組化驗(yàn)證MMP8與CRT表達(dá)：（1）低氟組、中氟組、高氟組的骨細(xì)胞MMP-8的IOD值均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低氟組成骨細(xì)胞MMP-8的IOD值高于對照組，差異有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）中氟組軟骨細(xì)胞CRT的IOD值低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低氟組成骨細(xì)胞CRT的IOD值低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：1成功構(gòu)建慢性氟中毒大鼠模型；骨組織形態(tài)計(jì)量及骨代謝標(biāo)志物檢測結(jié)果提示氟對成骨活性與破骨活性均有影響，且與染氟劑量有關(guān)。2、63個(gè)顯著差異蛋白、15條相關(guān)通路、51個(gè)互相作用蛋白可能直接或間接地參與了慢性氟中毒骨相損害分子機(jī)制。3. M