金雀異黃素納米緩釋-人工晶狀體載藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其抑制后發(fā)性白內(nèi)障的研究.pdf

1、目的：
　　本課題我們選擇了金雀異黃素作為抑制后發(fā)性白內(nèi)障的藥物、將其制備成納米脂質(zhì)載體的緩釋劑型、通過傳統(tǒng)的浸泡吸附法和創(chuàng)新的化學(xué)鍵合法將其加載到IOL上植入晶狀體囊袋內(nèi)作為給藥途徑，構(gòu)建金雀異黃素納米緩釋-人工晶狀體給藥系統(tǒng)，全面檢測該系統(tǒng)在體外和眼內(nèi)的藥物釋放特性，其對晶狀體上皮細(xì)胞增殖、移行、間充質(zhì)化的抑制情況，評價其對延緩控制兔眼內(nèi)后發(fā)性白內(nèi)障形成的有效性和對眼內(nèi)周圍組織安全性的效果，為其日后應(yīng)用于臨床防治后發(fā)性白內(nèi)障的

2、發(fā)生提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA01/04）由遼寧省晶狀體學(xué)重點實驗室提供;新西蘭大耳白兔由中國醫(yī)科大學(xué)動物部提供;人工晶狀體購于相關(guān)品牌代理商。
　　二、實驗方法和檢測指標(biāo)
　　1、CCK-8法檢測金雀異黃素納米脂質(zhì)載體(Gen-NLC)對細(xì)胞活力的影響并確定細(xì)胞實驗使用的藥物濃度。
　　2、細(xì)胞劃痕實驗檢測金雀異黃素納米脂質(zhì)載體對轉(zhuǎn)化生長因子-β(T

3、GF-β)誘導(dǎo)的細(xì)胞移行能力的影響。
　　3、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time qPCR)、免疫印跡法(western blot)和免疫熒光法(immunofluorescence assay)檢測金雀異黃素納米脂質(zhì)載體對TGF-β誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。
　　4、乳化超聲法制備殼聚糖鹽酸鹽修飾的金雀異黃素納米脂質(zhì)載體(Gen-NLC-CHC)和脫氧膽酸鈉修飾的金雀異黃素納米脂質(zhì)載體(Gen-NLC-SDC)

4、，并采用透射電鏡觀察其形態(tài)、采用激光納米粒度電位儀分別測定粒徑大小、分散指數(shù)、Zeta電位。
　　5、葡聚糖凝膠微柱法測定Gen-NLC-CHC和Gen-NLC-SDC的包封率。
　　6、差示掃描熱分析法(DSC)測定Gen-NLC-CHC和Gen-NLC-SDC凍干粉末的DSC圖譜。
　　7、采用透析技術(shù)檢測Gen-NLC-CHC和Gen-NLC-SDC的體外藥物溶出釋放度。
　　8、采用靜電力顯微鏡測量人工晶

5、狀體表面帶電性質(zhì)和帶電量。
　　9、浸泡吸附法、化學(xué)鍵合法制備金雀異黃素納米脂質(zhì)緩釋-人工晶體載藥系統(tǒng)(Gen-NLC-IOL)并采用掃描電鏡觀察人工晶狀體上的藥物形態(tài)。
　　10、采用透析法檢測不同人工晶狀體和不同納米脂質(zhì)載體通過不同方法構(gòu)建的Gen-NLC-IOL的體外藥物釋放度并比較不同組合的載藥量差異。
　　11、新西蘭白兔右眼行常規(guī)晶狀體超聲乳化吸除術(shù)建立動物后發(fā)性白內(nèi)障模型，術(shù)中分別植入普通IOL，植入普通

6、IOL聯(lián)合前房等量Gen-NLC注藥及植入Gen-NLC-IOL載藥系統(tǒng)。
　　12、采用透析技術(shù)檢測動物前房水中藥物釋放度，比較Gen-NLC-IOL組和前房注藥組藥物濃度變化的差異。
　　13、采用眼科裂隙燈顯微鏡連續(xù)觀察兔眼術(shù)后后囊膜變化，并比較對照組、前房注藥組和Gen-NLC-IOL組后囊膜混濁變化情況。
　　14、蘇木素-伊紅染色法光鏡下檢測不同組后囊膜細(xì)胞增殖移行的情況。
　　15、免疫組化SP法檢

7、測不同組后囊膜的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)量變化。
　　16、石蠟包埋固定切片蘇木素-伊紅染色染色光鏡下檢測角膜內(nèi)皮和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)形態(tài)的情況。
　　17、醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色法透射電鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜各層超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果：
　　一、金雀異黃素納米脂質(zhì)載體(Gen-NLC)對細(xì)胞增殖的影響
　　CCK-8實驗檢測加入不同濃度的納米脂質(zhì)載體(NLC)后，細(xì)胞活力未見明顯下降，即

8、NLC未對細(xì)胞有明顯的抑制效果，即使加入高濃度NLC(75mg/L)時，細(xì)胞活力仍在90％以上。
　　二、金雀異黃素納米脂質(zhì)載體(Gen-NLC)對細(xì)胞移行的影響
　　細(xì)胞劃痕實驗通過測量細(xì)胞劃痕的閉合情況來檢測細(xì)胞遷移能力的變化。在加入轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)后，細(xì)胞移行能力增加，劃痕恢復(fù)能力強(qiáng)，閉合程度高，在加入低濃度和高濃度的Gen-NLC后各組劃痕的閉合程度降低，其中高濃度實驗組對細(xì)胞移行抑制更加明顯，低濃度和

9、高濃度實驗組細(xì)胞劃痕寬度恢復(fù)百分率與TGF-β組相比，均差異有統(tǒng)計學(xué)意(P＜0.001)。
　　三、金雀異黃素納米脂質(zhì)載體(Gen-NLC)對上皮細(xì)胞間充質(zhì)化的影響
　　α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是評價上皮細(xì)胞間充質(zhì)化的重要指標(biāo)之一，利用real time qPCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TGF-β組α-SMA的mRNA水平明顯升高，加入不同濃度Gen-NLC之后，α-SMA的mRNA水平均降低，高濃度和低濃度實驗

10、組與TGF-β組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　四、帶電金雀異黃素納米脂質(zhì)載體特性的檢測結(jié)果
　　Gen-NLC-SDC/CHC納米粒直徑比Gen-NLC略增加，但是均保持在100nm左右，加入殼聚糖鹽酸鹽的納米粒帶有正電，而加入脫氧膽酸鈉的納米粒帶負(fù)電，所有的納米粒的包封率均在90％以上。
　　五、不同人工晶狀體表面電性和帶電荷量
　　聚甲基丙烯酸甲酯人工晶狀體:(RS-55B，AAREN)帶電量為0

11、.91×106/cm2。疏水性丙烯酸酯人工晶狀體:(EC-3Y，AAREN)帶正電為2.0×106/cm2;(HOYA，YA-60BB)帶電量為-2.4×106/cm2。親水性丙烯酸酯人工晶狀體:(570C，Rayner)帶正電為0.05×106/cm2;(Akreos Adapt，Baush&Lomb)帶負(fù)電為-0.072×106/cm2。硅凝膠人工晶狀體(KS-3Ai，CANON)帶負(fù)電為-0.0063×106/cm2。
　　

12、六、金雀異黃素納米緩釋-人工晶狀體載藥系統(tǒng)(Gen-NLC-IOL)的構(gòu)建及優(yōu)化
　?。ㄒ唬┤斯ぞ铙w的材質(zhì)對載藥量的影響
　　通過浸泡吸附法載藥顯示:親水性丙烯酸酯IOL載藥量最高，其次是疏水性丙烯酸酯IOL，而聚甲基丙烯酸甲酯IOL和硅凝膠IOL最少，除了PMMA和硅凝膠IOL，不同材質(zhì)IOL載藥量有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。
　?。ǘ┘{米脂質(zhì)載體的電性電量對載藥量的影響
　　當(dāng)IOL與NLC電性相反時

13、（即帶正電的IOL與帶負(fù)電的Gen-NLC，或者帶負(fù)電IOL與帶正電Gen-NLC結(jié)合），平均載藥量為14.65±1.64μg，當(dāng)IOL與Gen-NLC電性相同時（即帶正電的IOL與帶正電的Gen-NLC或帶負(fù)電的IOL與帶負(fù)電的Gen-NLC結(jié)合）平均載藥量為11.16±1.20μg，兩者相比，當(dāng)電性相反時載藥量明顯比相同時多，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)，說明IOL表面電荷性質(zhì)與藥物納米粒之間的靜電吸附力可影響浸泡吸附法載藥量。<

14、br>　　（三）鍵合法和浸泡吸附法對載藥量的影響
　　化學(xué)鍵合法最大的載藥結(jié)合方式是親水性丙烯酸酯IOL與-20mv的Gen-NLC結(jié)合。浸泡法最大載藥量的方式的親水性丙烯酸酯IOL與其電性相反的I20ImvNLC結(jié)合。
　　七、不同給藥途徑前房水藥物濃度的比較
　　前房注藥組和Gen-NLC-IOL組的藥物濃度均在手術(shù)后6小時內(nèi)達(dá)到峰值，隨時間延長濃度逐漸下降;Gen-NLC-IOL組的藥物濃度在任何時間點均顯著高于

15、前房注藥組，兩組藥物濃度在6h、12h、24h、48h和72h時間點均有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.001)。
　　八、不同給藥途徑對后囊膜情況的觀察和比較
　　體內(nèi)動物實驗:術(shù)后連續(xù)12周觀察后囊膜變化。在術(shù)后2周時，對照組可見后囊膜周邊區(qū)輕度混濁，而前房注藥組和實驗組后囊膜均保持透明;在術(shù)后4周時，對照組后囊膜混濁加重，可見上皮細(xì)胞增殖、移行，皮質(zhì)增生，前房注藥組可見后囊膜輕度混濁，囊膜皺縮，而實驗組后囊膜保持透明;在12周時，

16、對照組后囊膜周邊區(qū)和中央?yún)^(qū)全部混濁，前房注藥組可見周邊囊膜片狀致密纖維化混濁，并累及后囊膜中央?yún)^(qū)，而實驗組可見周邊后囊膜輕度混濁，中央?yún)^(qū)透明。
　　體外細(xì)胞實驗:術(shù)后4周處死動物后觀察后囊膜晶狀體上皮細(xì)胞增殖情況可見對照組晶狀體上皮細(xì)胞增殖移行數(shù)量最多，且在周邊和中央?yún)^(qū)區(qū)均有分布;前房注藥組可見中央?yún)^(qū)少量細(xì)胞增殖移行;實驗組晶狀體后囊膜中央?yún)^(qū)未見明顯細(xì)胞增殖移行。
　　九、眼內(nèi)其他組織形態(tài)學(xué)的評價
　　光鏡下可見各組角

17、膜內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)平順，未見明顯缺失;視網(wǎng)膜10層結(jié)構(gòu)完整，未見明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)論：
　　1、金雀異黃素納米臘質(zhì)載體(Gen-NLC)可以有效的抑制人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、遷移和間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　2、金雀異黃素納米脂質(zhì)載體可以緩慢可控釋放藥物，納米脂質(zhì)載體是一種有效的緩釋給藥劑型。
　　3、通過浸泡吸附法載藥時人工晶狀體的材質(zhì)可以影響載藥量，其中親水性丙烯酸酯人工晶狀體載藥量最大。
　　4、通過浸