細(xì)菌脂多糖通過(guò)TLR-4通路抑制小鼠成骨細(xì)胞分化及基質(zhì)礦化的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　(1)培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1。
　　(2)用不同濃度的脂多糖培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1，利用免疫蛋白印跡測(cè)量TLR-4蛋白水平。
　　(3)用逆轉(zhuǎn)錄-PCR的方法測(cè)量，不同濃度劑量的脂多糖處理小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1中成骨標(biāo)志物ALP, OCN and Runx2的mRNA水平的變化，從而分析脂多糖對(duì)于成骨細(xì)胞成骨功能影響的計(jì)量依賴性。
　　(4)用不同濃度劑量的脂多糖作用于

2、小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1，檢測(cè)成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶活性和基質(zhì)骨化的計(jì)量依賴性，從而分析不同濃度的脂多糖對(duì)于成骨細(xì)胞，成骨作用的影響。
　　(5)不同濃度的脂多糖作用于去除siRNA-TLR-4表達(dá)（對(duì)TLR-4特異的siRNA轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞）小鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，利用Von Kossa法測(cè)量基質(zhì)骨化程度，檢測(cè)堿性磷酸酶的活性，并測(cè)量不同劑量的脂多糖對(duì)基因敲除成骨細(xì)胞細(xì)胞活性和凋亡的影響。
　　方法:
　

3、　(1)細(xì)胞系、組織、處理方法。
　　小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞用ATCC配方Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。細(xì)胞溶液中添加10％的胎牛血清，100 units/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素，放在5％ CO2，37℃的加濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。脂多糖(LPS)用苯酚從大腸桿菌0111:B4提取純化，并溶解在含2％血清α-MEM溶液中。設(shè)置脂多糖干擾組時(shí)，用0

4、，50，100，200，or400ng/mL脂多糖分別培養(yǎng)濃度為85％的成骨細(xì)胞0，4，8，12，or24h，為敲除TLR-4表達(dá)，將30or60nMsiRNA-TLR-4脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到成骨細(xì)胞，用任意序列的RNA作對(duì)照。
　　(2)蛋白印跡分析。
　　細(xì)胞漿的蛋白用細(xì)胞裂解液提取，并輔以蛋白酶抑制劑。蛋白樣品經(jīng)12％SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚乙二烯硝酸纖維素膜上。然后非特異性結(jié)合位點(diǎn)的被5％脫脂牛奶阻斷

5、并在4℃過(guò)夜，然后用TLR-4的兔多克隆抗體或a磷酸甘油醛脫氫酶在室溫下孵育2h，然后接種用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體在室溫下封閉1h。最后，用化學(xué)免疫發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)特異性結(jié)合。TLR-4水平用其與GAPDH相對(duì)灰度值表示。
　　(3)Von Kossa染色和堿性磷酸酶活性的測(cè)定。
　　將細(xì)胞在含10％胎牛血清α-MEM中培養(yǎng)并用0、50、200或400ng/ml的脂多糖干擾。用Von Kossa染色法測(cè)量M

6、C3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)礦化水平。通過(guò)堿性磷酸酶實(shí)驗(yàn)測(cè)量堿性磷酸酶的活性，將MC3T3-E1細(xì)胞碎裂，用2毫克蛋白濃度的細(xì)胞裂解液加入到測(cè)定緩沖液（1 mM氯化鎂，50 mM Tris-HCl，pH9.2）（同時(shí)加入2 mM磷酸對(duì)硝基苯酚）在37℃孵育10min后，再用0.45 MNaOH終止，在420 nm處用對(duì)硝基苯酚處理后，測(cè)量吸光度。用與對(duì)照組相比較相對(duì)值來(lái)表示堿性磷酸酶活性檢測(cè)的結(jié)果
　　(4)實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)量TLR-

7、4，ALP, OCN和Runx2的水平。
　　用mRNA Isolation and Purification試劑盒從細(xì)胞中分離總mRNA，取1μgmRNA，用one-step SYBR Green PCR Kits試劑盒合成檢測(cè)與TLR-4，ALP, OCN和Runx2配對(duì)鏈。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) TLR-4，ALP, OCN和Runx2的配對(duì)鏈的合成后將與分離的mRNA溶液混合，利用LightCycler2.0系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)

8、。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。用甘油醛-3磷酸脫氫酶做參照，基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)量用2-△△ct法測(cè)定。
　　(5) MTT細(xì)胞活性檢測(cè)。
　　將MC3T3-E1細(xì)胞分別放在含有0、50、100，200或400 ng/ml的脂多糖溶液中培養(yǎng)24h。同時(shí)設(shè)有空白對(duì)照組。加入20μL終濃度為5 mg/mL的MTT，將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)4h。之后小心移除上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，放置于搖床上震蕩10分鐘，充分溶解結(jié)晶，用移液器反復(fù)

9、吹吸使晶體溶解。培養(yǎng)板放于37℃培養(yǎng)，溶解氣泡后，用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定，結(jié)果計(jì)算公式為（實(shí)驗(yàn)孔的A570）/（對(duì)照孔的A570）×100％。
　　(6)細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
　　用AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，分析細(xì)胞凋亡的百分率。用MC3T3-E1細(xì)胞處理過(guò)的細(xì)胞在2000rpm下離心5min，然后用PBS洗滌兩次

10、，吸取250ul的2×Binding Buffer和250ul去離子水，混勻，接著將細(xì)胞懸浮于400μl1×Binding的緩沖液中，使?jié)舛葹?×105 cells/mL，再加入5μL AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶，上下顛倒混勻。處理過(guò)的細(xì)胞放于暗室進(jìn)行5-15min放射處理，然后進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，流式細(xì)胞儀參數(shù)調(diào)節(jié)(EX=488nmEm=530nm)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況，綠色銀光采用FITC通道通常為FL2來(lái)檢測(cè)，紅色熒光通

11、過(guò)P1通道一般為FL1來(lái)檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　(1)脂多糖能夠促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞生成TLR-4。
　　小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞分別于0、50、100、200或400ng/mL的脂多糖共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，mRNA TLR-4的水平會(huì)隨著脂多糖的計(jì)量的增大而升高，說(shuō)明mRNA TLR-4與脂多糖呈計(jì)量依賴性，同時(shí)還驗(yàn)證了mRNA TLR-4的水平與處理時(shí)間的相關(guān)性，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-

12、E1細(xì)胞TLR-4 mRNA的水平在用200ng/mL脂多糖共培養(yǎng)4h后迅速提高，培養(yǎng)6h和8h，TLR-4 mRNA的水平維持到一定的高值，其中培養(yǎng)8h后達(dá)到峰值，與培養(yǎng)4h和6h組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)LPS抑制成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性和基質(zhì)骨化。
　　用0、50、100、200或400ng/ml的脂多糖處理成骨細(xì)胞MC3T3-E1，其細(xì)胞的堿性磷酸酶活性顯著降低，不同濃度組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

13、5，P＜0.01，P＜0.001)，且呈劑量依賴性(P＜0.05)，用0、50、100、200或400ng/ml的脂多糖處理成骨細(xì)胞MC3T3-E1，其細(xì)胞的基質(zhì)骨化水平顯著降低，不同濃度組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001),且呈劑量依賴性(P＜0.05)，當(dāng)200或400ng/mL脂多糖加入到MC3T3-E1成骨細(xì)胞培養(yǎng)，成骨細(xì)胞MC3T3-E1形成礦化點(diǎn)明顯減少（P＜0.01200 ng/ml的LPS

14、或P＜0.001400 ng/ml的LPS，圖2C），呈劑量依賴性(P＜0.01)。
　　(3)LPS對(duì)成骨細(xì)胞成骨標(biāo)志物的影響。
　　隨著脂多糖濃度的提高，成骨細(xì)胞骨鈣素水平顯著性下降，其不同劑量組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尤其是當(dāng)濃度大于200ng/ml時(shí)，骨鈣素水平顯著性下降，當(dāng)濃度大于400ng/ml時(shí)，骨鈣素水平最低。研究發(fā)現(xiàn)Runx2水平與脂多糖計(jì)量關(guān)系是:隨著脂多糖濃度的提高，成骨細(xì)胞骨Runx2的骨化點(diǎn)顯著性下降

15、，其不同劑量組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尤其是當(dāng)濃度大于200ng/ml時(shí)，骨化水平顯著性下降，當(dāng)濃度大于400ng/ml時(shí)，固化點(diǎn)水平最低。
　　(4)脂多糖對(duì)于核糖核酸干擾介導(dǎo)，敲除TLR-4成骨細(xì)胞分化的影響。
　　通過(guò)TLR-4-specific siRNAs轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1后，成骨細(xì)胞TLR-4的表達(dá)顯著性降低，基質(zhì)骨化的水平顯著性升高，骨鈣素和OCN的水平也顯著性的高于對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，差異具有統(tǒng)

16、計(jì)學(xué)意義，p=0.012本部分從遺傳學(xué)基因水平證實(shí)了TLR-4為脂多糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的作用靶點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　(1)成功培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1。
　　(2)脂多糖促進(jìn)了成骨細(xì)胞MC3T3-E1 TLR-4蛋白表達(dá)，且呈計(jì)量和時(shí)間的相關(guān)性。
　　(3)用逆轉(zhuǎn)錄-PCR的方法測(cè)量，不同濃度劑量的脂多糖處理的成骨細(xì)胞系MC3T3-E1中成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶、骨鈣素、Runx2的變化，脂多糖對(duì)于成骨細(xì)胞

17、三種成骨功能標(biāo)志影響存在計(jì)量依賴性，呈負(fù)相關(guān)。
　　(4)用不同濃度劑量的脂多糖作用于成骨細(xì)胞系MC3T3-E1，檢測(cè)成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶活性和基質(zhì)骨化的計(jì)量依賴性，同時(shí)測(cè)量了不同劑量對(duì)成骨細(xì)胞凋亡和活性的影響，脂多糖對(duì)于成骨細(xì)胞，成骨作用具有抑制反應(yīng)，同時(shí)可以降低成骨細(xì)胞活性提高成骨細(xì)胞凋亡的比例。
　　(5)敲除TLR-4的成骨細(xì)胞MC3T3-E1其基質(zhì)骨化程度和堿性磷酸酶、OCN、Runx2的mRNA水平增高，敲除TL