重癥肌無(wú)力患者肌細(xì)胞分揀微管連接蛋白17的表達(dá)及作用分析.pdf

1、研究背景:重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis,MG)是最常見(jiàn)的神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）免疫疾病，世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為200-300/百萬(wàn)，臨床特點(diǎn)包括肌肉無(wú)力和易疲勞性，肌無(wú)力通常會(huì)在活動(dòng)后加重，休息或睡眠后緩解。神經(jīng)肌肉接頭是由高度特化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元構(gòu)成的突觸前膜、突觸間隙、以及由肌細(xì)胞膜構(gòu)成的突觸后膜組成，作用是參與神經(jīng)肌肉之間的信號(hào)傳導(dǎo)，將神經(jīng)興奮信號(hào)轉(zhuǎn)化為肌肉收縮。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元末梢釋放乙酰膽堿（ACh）活化突觸后膜的乙酰膽

2、堿受體（AChR），導(dǎo)致肌細(xì)胞膜表面離子通道開(kāi)放，使肌細(xì)胞去極化。AChR在反復(fù)折疊的突觸后膜呈高密度簇集分布，這種簇集分布是信號(hào)傳導(dǎo)的重要保證。哺乳動(dòng)物在出生以后，神經(jīng)肌肉接頭的突觸后膜形成褶皺樣結(jié)構(gòu)，AChR聚集在這些褶皺上，經(jīng)過(guò)測(cè)算可知其在突觸后膜上的10000-20000/um2，而在突觸外的結(jié)構(gòu)上密度僅為10/um2，這種現(xiàn)象涉及復(fù)雜的NMJ處的信號(hào)傳遞通路，目前關(guān)于AChR在NMJ的調(diào)節(jié)及聚集機(jī)制仍不明確。
　　過(guò)去的

3、幾十年中，已經(jīng)證實(shí)神經(jīng)肌肉接頭處有很多神經(jīng)源性、肌源性以及促進(jìn)不同分化的信號(hào)因子。這些因子包含跨膜蛋白、胞質(zhì)內(nèi)蛋白、以及胞外的一些重要蛋白，突觸處的基本蛋白包含兩種主要物質(zhì)即集聚蛋白（Agrin）和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，這兩種物質(zhì)由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元產(chǎn)生，并且在NMJ的結(jié)構(gòu)形成和維持方面有一定作用，其它的胞外蛋白如層聯(lián)蛋白、IV/XIII膠原蛋白，蛋白多糖對(duì)NMJ形成也有一定作用。在肌細(xì)胞膜表面，肌肉特異性酪氨酸激酶（MuSK）是募集其它胞內(nèi)、胞外物質(zhì)

4、的關(guān)鍵蛋白。膜表面低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4（LRP4）與MuSK形成的復(fù)合體對(duì)于NMJ的功能至關(guān)重要。在肌細(xì)胞內(nèi)部，很多蛋白如rapsyn蛋白、Dok7可以和MuSK結(jié)合傳遞信號(hào)誘導(dǎo)AChR在突觸后膜的聚集。目前，研究者普遍認(rèn)為Agrin-LRP4-MuSK復(fù)合體的信號(hào)傳遞通路在NMJ形過(guò)程起到重要作用，目前對(duì)這個(gè)復(fù)合體功能已有一定的認(rèn)識(shí)，AChR的簇集需要運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分泌的Agrin蛋白和突觸后膜的LRP4蛋白結(jié)合，Agrin-LRP

5、4復(fù)合體激活突觸后膜MuSK蛋白，誘導(dǎo)AChR在突觸后膜聚集。
　　低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4（LRP4）與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）均屬于LDLR家族成員，研究已經(jīng)表明LRP1在細(xì)胞內(nèi)的代謝與細(xì)胞分揀微管連接蛋白17（SNX17）有關(guān)，SNX17屬于細(xì)胞分揀微管連接蛋白(sorting nexin，SNX)家族成員，SNX家族包括存在于胞內(nèi)和胞膜的多種蛋白質(zhì)，其作用是參與跨膜蛋白的內(nèi)吞及在胞質(zhì)內(nèi)的分揀，SNX17蛋白

6、誘導(dǎo)LRP1在細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)利用，抑制LRP1被溶酶體降解，LRP1與LRP4具有相同的結(jié)構(gòu)域即NPxY結(jié)構(gòu)域，因此LRP4存在與SNX17結(jié)合的可能。
　　SNX17分布于所有組織，我們研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺中SNX17mRNA含量明顯增高，但SNX17在肌肉的表達(dá)情況及對(duì)NMJ處LRP4代謝影響情況未知。本研究在比較MG患者SNX17分子含量基礎(chǔ)上，用免疫熒光觀察SNX17與AChR形態(tài)，了解MG患者肌細(xì)胞SNX17分

7、子表達(dá)情況，分析與AChR分子的關(guān)系。
　　目的:本研究采用免疫熒光法觀察肌絲AChR、SNX17分子形態(tài)及分布；熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法比較兩組肌細(xì)胞SNX17含量。
　　方法:
　　1.免疫熒光法觀察大鼠AChR及人AChR、SNX17分子形態(tài)：取大鼠、MG組和對(duì)照組肋間肌標(biāo)本，4％多聚甲醛固定10min，在載玻片上的剝離單根肌絲，0.5%Triton X-100通透20min，5%BSA封閉1h，稀釋比例1

8、：50的鼠抗人SNX17抗體孵育4℃過(guò)夜。37℃復(fù)溫30min，稀釋比例1：100的AF-g350標(biāo)記羊抗鼠抗體及1：220的α-銀環(huán)蛇毒素標(biāo)記的四甲基羅丹明（α-BTX），37℃孵育1h，顯微鏡觀察不同激發(fā)光下的AChR、SNX17形態(tài)及分布。
　　2.熒光定量PCR法檢測(cè)肌細(xì)胞SNX17 mRNA含量：在Gene Bank中獲得人SNX17序列，Premier5.0設(shè)計(jì)引物,上游引物序列5，-CAATGGGT CTTGCCGA

9、ACAG-3，下游引物序列5,CGCCTACGTGGCCTATAACAT-3，β-actin作為內(nèi)參，其上游引物序列為5，-GGGCCGGACTCGTCATACT-3，下游引物序列為5，-CCTGGCACCCAGCACAAT-3，取上述肋間肌各20mg，用Trizol一步法提取RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，熒光定量PCR法采用20ul反應(yīng)體系,熒光變性反應(yīng)條件為95℃30S；PCR反應(yīng)條件：95℃5S、55℃2mi

10、n、72℃30S，40個(gè)循環(huán)；取10ulPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以確保引物設(shè)計(jì)的特異性。將內(nèi)參基因Ct值與目的基因的Ct值之比作為標(biāo)準(zhǔn)化的目的基因相對(duì)定量，即β-actin的拷貝數(shù)/目的基因拷貝數(shù)。
　　3.蛋白免疫印跡法檢測(cè)肌細(xì)胞SNX17蛋白含量：取上述肋間肌各20mg，液氮中快速研磨得到勻漿，加入裂解液，室溫避光30min，5000r/min離心5min后取上清，BCA法測(cè)細(xì)胞蛋白濃度，每孔加20μl樣品，β-ac

11、tin作為內(nèi)參，稀釋比例1：1000鼠抗人SNX17抗體及1：2000兔抗人β-actin抗體孵育4℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫30min，稀釋比例1：4000HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體和1：4000HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體37℃孵育1h，曝光成膠片，采用圖像分析軟件Quantity One分別測(cè)定目的基因和β-actin的顯色條帶平均值，各組蛋白表達(dá)強(qiáng)度為二者平均值比值。
　　結(jié)果:
　　1.患者一般臨床資料：對(duì)MG組（10例）與對(duì)照組（

12、14例）的年齡、性別進(jìn)行比較，兩組患者的年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。
　　2.AChR、SNX17形態(tài)學(xué)觀察：AChR一般位于肌纖維縱軸的中部，呈紅色橢圓形突起狀，輪廓線光滑連續(xù)完整。對(duì)照組AChR呈曲奇餅干樣，內(nèi)部有精細(xì)分支的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；而MG組僅可觀察到呈不連續(xù)完整的紅色外周輪廓線，內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破碎，呈空泡樣；但可觀察到SNX17呈同樣形狀藍(lán)色橢圓形突起，兩者位置、形態(tài)一致，經(jīng)Merge后，圖像完全重疊（圖1、圖2）。

13、
　　3.肌細(xì)胞中SNX17基因和蛋白定量結(jié)果：熒光定量PCR法結(jié)果顯示，MG組SNX17 mRNA含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.75，P<0.05），蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，SNX17蛋白含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.03，P<0.05）（圖3，表1）。
　　結(jié)論:
　?。?）MG患者肋間肌肌細(xì)胞SNX17表達(dá)增高，存在促進(jìn)LRP4在細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)的可能性。
　?。?）SNX17與AChR在神