口服雷帕霉素酵母微囊遞送系統(tǒng)在靶向治療動脈粥樣硬化中的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)與多種心腦血管疾病如心肌梗死、腦梗死、腎缺血、間歇性跛行等有密切且直接的關(guān)系。近期研究表明，通過抑制平滑肌細胞增殖和遷移、選擇性清除巨噬細胞以及其抗炎等多種作用，免疫抑制藥物雷帕霉素(Rapamycin，RAP)及其衍生物能夠減小AS斑塊面積、改善斑塊組成、并顯著提高斑塊穩(wěn)定性，進而有效抑制AS發(fā)展。然而，目前的RAP制劑多為系統(tǒng)性給藥，其血漿半衰期短，迅速從靶部位消除，導(dǎo)致AS斑塊部位藥物難以維持最低有效治療濃度;

2、藥物均勻分布于各組織器官，無特異性導(dǎo)致全身毒副作用;故治療效果十分有限，即使提高給藥劑量也很難達到理想療效。因此，開發(fā)有效性高、毒副作用低、患者依從性好的具有靶向性能的口服RAP藥物遞送系統(tǒng)，對治療AS具有重要意義。
　　目的：
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過仿生途徑，利用去除內(nèi)容物的酵母微囊可以通過口服途徑靶向至腫瘤部位及急性炎癥部位。因此，在本課題中，通過類似的原理，模仿病菌通過腸道侵染機體的途徑，利用酵母微囊作為載體，

3、構(gòu)建了用于治療AS的口服RAP靶向遞送系統(tǒng)。
　　方法：
　　1.空白酵母微囊的制備
　　稱取一定量的啤酒酵母，經(jīng)酸、堿、有機溶劑等處理后除去內(nèi)容物，干燥后即得空白酵母微囊(YC)。
　　2.酵母微囊對不同粒徑的納米粒的負載性能評價
　　稱取一定量的YC用pH9.2碳酸鹽緩沖液制備成混懸液，于37℃孵育30 min后，加入枝化聚乙烯亞胺(PEI)，其中YC/PEI質(zhì)量比為2∶1，孵育過夜，離心水洗多次后，重

4、懸液加入不同粒徑的羧基修飾的聚苯乙烯納米粒，37℃孵育8h，離心水洗后，用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)及透射電子顯微鏡(TEM)對酵母微囊負載納米粒情況進行表征。
　　3.雷帕霉素納米粒的制備及表征
　　稱取一定量的PEI、含羧基小分子藥物及疏水性藥物雷帕霉素(RAP)共溶于二甲基亞砜(DMSO)中，置于透析袋中，在純水中透析24 h后即得RAP納米粒(RAP NP)。測定其粒徑大小及表面電位，利用TEM對納米粒的形貌進行表

5、征。
　　4.雷帕霉素酵母微囊的制備及表征
　　稱取一定量的YC用水制備成混懸液，于40℃混懸孵育30 min后加入RAP NP混懸液，25℃混懸孵育過夜后，離心水洗后，凍干即得雷帕霉素酵母微囊(YC/RAP)。測定其表面電位，用高效液相色譜法(HPLC)測定載藥量，TEM及CLSM對納米粒在酵母微囊內(nèi)部的包埋情況進行觀察。
　　5.雷帕霉素酵母微囊的體外釋放評價
　　配制pH1.2及pH7.4的磷酸鹽緩沖液分別

6、模擬胃腸道酸堿環(huán)境，將載藥酵母微囊置于此模擬環(huán)境及RPMI1640培養(yǎng)基中，于特定時間離心取上清液。用HPLC測定RAP的釋放量。
　　6.巨噬細胞對YC的吞噬性能評價
　　將5-(4，6-二氯三嗪基)氨基熒光素(DTAF)標記的YC(YC/DTAF)與RAW264.7細胞共孵育不同時間，清洗掉未吞噬的YC/DTAF后，溶酶體及細胞核染色，利用CLSM和流式細胞儀對YC被巨噬細胞吞噬的情況進行評價。
　　7.巨噬細胞對

7、YC/RAP的吞噬及藥物胞內(nèi)保留特性評價
　　將巨噬細胞種植于孔板，加入YC/RAP孵育不同時間后，PBS清洗，用細胞裂解液裂解細胞，離心取上清，測定總蛋白含量，用HPLC測定溶液中RAP濃度。
　　8.口服酵母微囊對動脈粥樣硬化斑塊的靶向作用研究
　　首先通過化學(xué)反應(yīng)將近紅外熒光花青染料7.5(Cy7.5)化學(xué)鍵合到PEI上面，用純水透析后制備得到Cy7.5納米粒(Cy7.5 NPs)，然后將YC混懸液與Cy7.5

8、NPs孵育得到熒光標記的酵母微囊(YC/Cy7.5)。載脂蛋白E缺陷(ApoE-/-)小鼠給予高脂飲食建立動脈粥樣硬化模型，分別口服灌胃給予Cy7.5 NPs或YC/Cy7.5連續(xù)4天后，于第5天解剖取主動脈及各臟器組織，剝離脂肪后用活體成像觀察并統(tǒng)計熒光強度。
　　9.口服酵母微囊靶向動脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)運機制的初步研究
　　基于ApoE-/-小鼠建立AS模型，口服灌注YC/DTAF連續(xù)兩天后，于第3天解剖取主動脈及脾臟，

9、分離巨噬細胞，免疫熒光染色后，用CLSM觀察。
　　10.口服載藥酵母微囊治療動脈粥樣硬化的藥效學(xué)評價
　　以ApoE-/-小鼠建立AS模型，口服給予生理鹽水、YC、RAP、RAP NP及YC/RAP，每三天一次，給藥2個月后，取主動脈用油紅O染色評價斑塊生長情況;主動脈根部切片進行免疫組化染色后評價斑塊、膠原等分布情況;取全血用流式細胞術(shù)測定單核巨噬細胞比例。
　　11.口服載藥酵母微囊治療動脈粥樣硬化的初步安全性研

10、究
　　取全血測定血常規(guī);取血清測定血脂水平、腎功能、肝功能等;取血清測定炎性因子及活性氧水平;取主動脈研磨后測定組織炎性因子及活性氧含量;取各臟器稱重計算臟器指數(shù);取各臟器及胃腸道進行切片并做H&E染色觀察臟器組織病理形態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1.基于靜電相互作用，PEI預(yù)處理的YC能夠負載不同粒徑大小的負電荷納米粒，其最大粒徑為750 nm。
　　2.基于同樣的靜電作用介導(dǎo)的自沉積過程，通過簡單的混懸過程，YC

11、能夠成功負載正電荷的納米粒，CLSM及TEM觀察顯示，納米粒分散于酵母微囊的內(nèi)部。HPLC測定表明YC/RAP載藥量為1.0-4.5％，載藥量與混懸孵育的時間及溫度相關(guān)。
　　3.YC/RAP在pH1.2酸性介質(zhì)中藥物釋放緩慢，而在pH7.4的環(huán)境下藥物釋放較為迅速。
　　4.酵母微囊能夠被巨噬細胞迅速吞噬，并且呈時間依賴性。同樣，載藥酵母微囊可被巨噬細胞吞噬，其藥物RAP在胞內(nèi)保留時間較長。
　　5.活體成像結(jié)果顯示

12、，YC/Cy7.5經(jīng)口服后能夠顯著提高Cy7.5在動脈粥樣硬化斑塊部位的富集，分析各臟器組織熒光強度可以發(fā)現(xiàn)，在淋巴相關(guān)的腸系膜淋巴結(jié)、胸腺及小腸部位的熒光強度亦有顯著增加。
　　6.分離小鼠的脾臟及主動脈組織的巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)酵母微囊主要分布于巨噬細胞內(nèi)部。
　　7.油紅O染色顯示，口服YC/RAP后能夠使ApoE-/-小鼠的AS斑塊的比例顯著降低，血清中相關(guān)促炎因子及活性氧水平顯著降低。
　　8.初步安全性評價表明血

13、液生理指標、肝腎功能均無顯著差異，臟器組織及胃腸道切片無明顯病理變化。
　　結(jié)論：
　　1.基于靜電作用，YC能夠負載的納米粒的最大粒徑為～750 nm。通過自組裝制備的帶有正電荷的RAP納米粒，可以成功負載于YC內(nèi)部。
　　2.巨噬細胞能夠有效吞噬載RAP酵母微囊。
　　3.口服給藥后，YC能夠靶向至小鼠動脈粥樣硬化斑塊部位，此過程與淋巴系統(tǒng)及組織關(guān)系密切。單核巨噬細胞在靶向過程中可能發(fā)揮重要的作用。