通過(guò)激光拉曼光譜系統(tǒng)無(wú)損區(qū)分大鼠原代胰島α、β、δ及pp細(xì)胞.pdf

1、目的：可見(jiàn)光與細(xì)胞內(nèi)分子作用發(fā)生拉曼散射。通過(guò)分析拉曼散射光譜，可獲得細(xì)胞的“分子指紋”。將其用于不同種類(lèi)細(xì)胞的辨識(shí)、分選是目前單細(xì)胞拉曼光譜研究的前沿領(lǐng)域。然而，四類(lèi)胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的分離及純化仍是個(gè)難題，故本實(shí)驗(yàn)將拉曼光譜技術(shù)引入大鼠原代胰島α、β、δ及pp細(xì)胞的分離及純化中，探討并比較該方法與傳統(tǒng)方法在區(qū)分四種胰島細(xì)胞方面的優(yōu)劣，以期為大鼠原代胰島細(xì)胞的純化提供一種新的手段。
　　方法：以Sprague-Dawley大鼠為動(dòng)物

2、模型，提取原代胰島并消化成胰島細(xì)胞混合細(xì)胞懸液，種植于細(xì)胞定位格子培養(yǎng)皿中，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁穩(wěn)定，收集細(xì)胞定位格子培養(yǎng)皿中大鼠胰島細(xì)胞的拉曼光譜、坐標(biāo)及照片，然后分別以胰高血糖素、胰島素、生長(zhǎng)抑素及胰多肽作為一抗分批次對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫組化染色，根據(jù)免疫組化結(jié)果結(jié)合培養(yǎng)皿坐標(biāo)定位確定培養(yǎng)皿中每個(gè)胰島細(xì)胞的分類(lèi)，并根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)將細(xì)胞光譜及細(xì)胞直徑等數(shù)據(jù)分為4組，即α細(xì)胞組、β細(xì)胞組、δ細(xì)胞組及pp細(xì)胞組。四類(lèi)細(xì)胞拉曼光譜特征峰及面積差異

3、采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用主成分分析聯(lián)合線(xiàn)性判別分析法對(duì)四種胰島細(xì)胞拉曼光譜進(jìn)行分析以計(jì)算光譜對(duì)胰島細(xì)胞的區(qū)分正確率，用線(xiàn)性判別分析法對(duì)以細(xì)胞大小區(qū)分細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。此外，采用MTT法及胰島素分泌試驗(yàn)法比較拉曼光譜采集數(shù)據(jù)后的細(xì)胞群體與細(xì)胞培養(yǎng)箱中的細(xì)胞群體活性的差異，采用吖啶橙/碘化丙啶雙染法比較兩組細(xì)胞活性率。
　　結(jié)果：貼壁生長(zhǎng)的胰島β細(xì)胞面積較其他胰島細(xì)胞大，四種細(xì)胞之間面積的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；然而單純利用面積對(duì)

4、四種胰島細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，正確區(qū)分率僅為38.3％。四種胰島細(xì)胞的拉曼光譜既有共同的特征峰也存在差異顯著的波峰，即二者有不同的“細(xì)胞分子指紋”，方差分析結(jié)果顯示在530 cm-1、725 cm-1、785 cm-1、828 cm-1、852 cm-1、893 cm-1、937 cm-1、947 cm-1、1002 cm-1、1053 cm-1、1091 cm-1、1128 cm-1、1209 cm-1、1255 cm-1、1301 cm-1

5、、1342 cm-1、1575 cm-1、1615cm-1以及1665 cm-1處四種細(xì)胞波峰強(qiáng)度有顯著差異；且將該特點(diǎn)結(jié)合主成分分析聯(lián)合線(xiàn)性判別分析的方法對(duì)胰島α、β、δ及pp細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，正確率為98.6%，經(jīng)交叉驗(yàn)證其正確分類(lèi)率為93.6%；且細(xì)胞活性鑒定實(shí)驗(yàn)表明該實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞活性與培養(yǎng)箱中細(xì)胞活性相當(dāng)，MTT結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組吸光度A值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞在高糖刺激下胰島素分泌效率相當(dāng)，細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。