脈沖電磁場(chǎng)通過(guò)初級(jí)纖毛和BMP-BMPRII-Smad1-5-8信號(hào)途徑促進(jìn)骨形成的研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種因骨密度降低、骨量減少而導(dǎo)致骨折危險(xiǎn)性增加的全身性骨骼疾病，目前還沒(méi)有療效好且副作用低的骨質(zhì)疏松治療藥物。脈沖電磁場(chǎng)（PEMFs）作為一種非侵入物理治療手段，被認(rèn)為是安全有效的骨質(zhì)疏松癥治療方法之一，本實(shí)驗(yàn)組前期研究已篩選出能夠顯著促進(jìn)骨形成的脈沖電磁場(chǎng)參數(shù)，包括磁場(chǎng)強(qiáng)度、頻率、作用時(shí)間等。在這些參數(shù)條件下，脈沖電磁場(chǎng)顯著促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的成骨性分化及礦化成熟，并能夠提高生長(zhǎng)大鼠的峰值骨量。然而，脈沖

2、電磁場(chǎng)促進(jìn)骨形成的作用機(jī)理至今仍不清楚，是制約電磁場(chǎng)應(yīng)用于骨質(zhì)疏松治療的主要瓶頸。本實(shí)驗(yàn)組在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，50 Hz0.6mT的脈沖電磁場(chǎng)是促進(jìn)骨形成的最佳參數(shù)之一，在該參數(shù)條件下脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)骨形成依賴于細(xì)胞表面的“天線樣”細(xì)胞器——初級(jí)纖毛。鑒于上述研究結(jié)果，本論文開展了脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)骨形成與初級(jí)纖毛及相關(guān)信號(hào)途徑關(guān)系的研究。
　　首先，實(shí)驗(yàn)以大鼠顱骨中分離得到的骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞為材料，利用免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色

3、以及western blot技術(shù)，對(duì)兩者形態(tài)、成骨性相關(guān)蛋白的表達(dá)等進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：骨細(xì)胞多呈樹突狀，而成骨細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形；成骨細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）的活性、成骨相關(guān)因子I型膠原（COL-I）和骨鈣素（OC）的表達(dá)量均顯著高于骨細(xì)胞；成骨細(xì)胞對(duì)外界促進(jìn)骨形成的因子更加敏感，因此后續(xù)研究均采用成骨細(xì)胞。
　　其次，為了研究PEMFs促進(jìn)骨形成是否依賴于BMP2-Smad信號(hào)途徑，實(shí)驗(yàn)用50 Hz0.6mT PEMFs處理

4、大鼠顱骨成骨細(xì)胞不同時(shí)間后，通過(guò)western blot檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）、Smad1/5/8和p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá)量，免疫熒光染色法檢測(cè)p-Smad1/5/8核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEMFs能夠顯著提高BMP-2的表達(dá)量，促進(jìn)Smad1/5/8快速發(fā)生磷酸化，并使 p-Smad1/5/8發(fā)生核轉(zhuǎn)位，說(shuō)明50 Hz0.6mT PEMFs能夠激活BMP2-Smad信號(hào)途徑。為檢測(cè)激活BMP2-Smad信號(hào)途徑是否

5、為PEMFs促進(jìn)骨形成所必需，本實(shí)驗(yàn)用BMPs阻斷劑Noggin和BMPR1激酶的抑制劑LDN1459阻斷BMP2-Smad信號(hào)途徑后，檢測(cè)了成骨相關(guān)指標(biāo)的變化。發(fā)現(xiàn)PEMFs誘導(dǎo)的ALP活性升高、骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)的增加以及鈣化結(jié)節(jié)形成增多的現(xiàn)象均被抑制，說(shuō)明 PEMFs促進(jìn)骨形成依賴于BMP2-Smad信號(hào)途徑。
　　最后，為了研究PEMFs激活BMP2-Smad信號(hào)途徑是否與初級(jí)纖毛有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾法抑制IFT88

6、的表達(dá)，從而抑制初級(jí)纖毛的發(fā)生后，檢測(cè)BMP2-Smad信號(hào)途徑的激活是否受到影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEMFs促進(jìn)BMP-2和p-Smad1/5/8的表達(dá)以及p-Smad1/5/8發(fā)生核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象均被抑制，PEMFs激活BMP2-Smad信號(hào)途徑的作用消失。因此推測(cè)BMP2-Smad信號(hào)途徑中的某種蛋白可能定位于初級(jí)纖毛中，為此實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)，對(duì)BMP2的三種受體BMPRIA、BMPRIB和BMPRII進(jìn)行了初級(jí)纖毛共定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

7、BMPRII定位于初級(jí)纖毛根部，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PEMFs能夠顯著促進(jìn)BMPRIB和BMPRII蛋白的表達(dá)。通過(guò)RNA干擾法抑制初級(jí)纖毛后。BMPRII定位于初級(jí)纖毛基部及BMPRII表達(dá)量增加的現(xiàn)象均消失。結(jié)果說(shuō)明BMPRII是聯(lián)接初級(jí)纖毛和BMP2-Smad信號(hào)途徑的關(guān)鍵蛋白。為了研究BMPRII在PEMFs促進(jìn)骨形成過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)而用RNA干擾法抑制BMPRII的表達(dá)后檢測(cè)成骨性指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEMFs提高ALP活性，促進(jìn)骨形成