巨噬細胞EPO-EPOR信號通路促進凋亡細胞清除和免疫耐受.pdf

1、人體由于細胞分化、發(fā)育、感染、衰老等原因，體內(nèi)每天產(chǎn)生數(shù)以十億計的凋亡細胞。細胞凋亡是一個消耗能量的生物學過程，如果凋亡細胞沒有被及時清除，凋亡細胞會發(fā)生二次壞死。發(fā)生二次壞死的凋亡細胞不能維持細胞膜的完整性，導致其細胞膜會破裂從而釋放細胞內(nèi)容物如自身抗原。正常情況下體內(nèi)的凋亡細胞能夠被巨噬細胞、樹突狀細胞、內(nèi)皮細胞等專職和非專職吞噬細胞及時有效地吞噬清除，以防止細胞內(nèi)自身抗原等內(nèi)容物的釋放和機體自身免疫應答的激活。因而吞噬細胞對凋亡細

2、胞的吞噬清除對于維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是累及皮膚、腎臟、心血管和神經(jīng)等多個組織和器官的慢性自身免疫性疾病。SLE患者外周血中有大量針對自身抗原的自身免疫性抗體如抗核抗體(ANA)和抗DNA抗體(ADA)。研究表明對凋亡細胞吞噬清除障礙是SLE發(fā)病的重要原因之一，SLE患者體內(nèi)巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬能力較健康人顯著降低，而同時體內(nèi)有大量未被及時吞噬清除的凋亡細胞積累。
　　凋亡細胞細胞能夠

3、釋放“find me”信號分子以有效的募集吞噬細胞。研究表明凋亡細胞能夠通過caspase依賴的方式激活鞘氨醇激酶(Sphk)，后者能合成S1P。凋亡細胞釋放的S1P作為“find me”信號分子，通過巨噬細胞表面表達的S1P受體1(S1PR1)誘導巨噬細胞向凋亡細胞的定向趨化作用。研究表明在SLE患者外周血單個核細胞和自發(fā)性紅斑狼瘡Faslpr/lpr小鼠的脾臟中，S1PR1的mRNA和蛋白表達水平均顯著低于正常對照。提示“find

4、me”分子S1P在凋亡細胞清除和SLE發(fā)病中起著重要作用。除了分泌和釋放“find me”分子，凋亡細胞表面還提供“eat me”信號分子給巨噬細胞識別，因而巨噬細胞能夠識別并吞噬凋亡細胞而非正常的活細胞。目前研究最廣泛的“eat me”信號分子是磷脂酰絲氨醇(PS)。PS是細胞膜的組成成分之一，正常細胞中PS定位在細胞膜脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)側面，只有當細胞凋亡時PS才外翻至細胞膜的外側面，阻斷凋亡細胞表面的PS能夠阻斷巨噬細胞對凋亡細胞的

5、吞噬。除此之外，巨噬細胞自身能夠合成分泌某些蛋白分子以識別并結合PS，例如乳脂肪球表面生長因子8(MFG-E8)和生長停止特異性蛋白6(Gas6)。MFG-E8能夠與PS結合，并通過整合素介導巨噬細胞對PS的識別。血漿中的Gas6能夠結合凋亡細胞表面外翻的PS，而與巨噬細胞上的酪氨酸激酶受體Mer結合，從而介導巨噬細胞對PS的識別與結合。研究表明，Mfge8缺陷的小鼠出現(xiàn)年齡依賴的SLE自身免疫表型，體內(nèi)產(chǎn)生高濃度的ANA和ADA，而M

6、er缺陷的小鼠也會出現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣的自身免疫性癥狀。這些結果均說明凋亡細胞吞噬清除障礙是機體自身免疫性疾病的重要原因之一。
　　激素類糖蛋白分子促紅細胞生成素(EPO)是促進機體造血過程的重要調(diào)控因子。EPO下調(diào)紅細胞前體細胞上的FasL/Fas表達而抑制未成熟紅細胞的凋亡，增加外周血成熟紅細胞的數(shù)量促進機體造血功能。最近的研究表明，EPO還具有炎癥調(diào)控功能。在我們之前的報道中EPO能夠抑制大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎的炎癥因子

7、表達和炎癥細胞的浸潤，具有顯著的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞表達促紅細胞生成素受體(EPOR)并且是EPO調(diào)控炎癥的重要靶細胞。EPO能夠通過抑制巨噬細胞在LPS和IFN-γ等炎癥刺激下NF-κB的活化而抑制TNF-α，IL-6和IL-12等促炎因子的表達與釋放。此外研究發(fā)現(xiàn)EPO能夠促進人外周血單核巨噬細胞對細菌和顆粒物的吞噬。在小鼠模型中，向野生型C57BL/6小鼠腹腔注射EPO后其腹腔巨噬細胞對細菌和顆粒物的吞噬率顯著增加。在EPO

8、過表達的轉(zhuǎn)基因tg6小鼠中研究也發(fā)現(xiàn)腹腔巨噬細胞對細菌和顆粒物的吞噬顯著高于野生型小鼠。在tg6小鼠中進一步研究表明tg6小鼠巨噬細胞對紅細胞的吞噬能力顯著高于野生型小鼠，而巨噬細胞對紅細胞的吞噬機制與凋亡細胞吞噬類似，都是PS外翻、Mer介導的吞噬過程，因而上述結果提示EPO能夠促進巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬作用。
　　臨床研究提示SLE患者中EPO/EPOR信號通路的功能障礙與SLE疾病嚴重度有密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血

9、中EPO的濃度顯著低于健康人，46％的SLE患者外周血中檢出抗EPO抗體，且抗EPO抗體陽性的SLE患者其體內(nèi)抗雙鏈DNA滴度顯著高于抗EPO抗體陰性的SLE患者，提示SLE病人中EPO信號通路的功能不足與SLE自身免疫性反應的潛在關聯(lián)。除了抗EPO抗體，研究發(fā)現(xiàn)SLE患者中還存在抗EPOR抗體，抗EPOR抗體陽性的SLE患者其抗雙鏈DNA抗體和疾病活動度均較高。另一研究證實SLE患者血清中的抗EPOR自身抗體能夠中和體內(nèi)EPO活性。上

10、述臨床研究結果均提示SLE患者體內(nèi)EPO/EPOR信號通路功能障礙，且抗EPO/EPOR抗體與患者自身免疫性嚴重程度呈正相關。
　　我們的研究表明，凋亡細胞釋放的“find me”分子S1P能夠誘導巨噬細胞EPO/EPOR通路的表達和活化。EPO/EPOR通過誘導巨噬細胞PPARγ的表達促進其對凋亡細胞的吞噬。巨噬細胞EPOR條件性敲除后對凋亡細胞的吞噬顯著降低，相應的EPOR-cKO小鼠出現(xiàn)年齡依賴的凋亡細胞累積和系統(tǒng)性自身免疫

11、性癥狀，具體而言我們做了以下工作。
　　在第一部分的研究中，體外實驗發(fā)現(xiàn)凋亡細胞條件化培養(yǎng)基和S1P誘導小鼠腹腔巨噬細胞HIF-1α、EPO、EPOR和p-Jak2的表達，而缺乏S1P的凋亡細胞條件化培養(yǎng)基不具有誘導巨噬細胞EPO/EPOR通路表達的作用，阻斷巨噬細胞S1PR1能夠抑制凋亡細胞培養(yǎng)基和S1P的上述作用。體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)注射外源性凋亡細胞培養(yǎng)基和S1P體內(nèi)通過S1PR1誘導巨噬細胞EPO/EPOR信號通路的表達以及活化

12、。使用注射地塞米松誘導內(nèi)源性細胞凋亡能夠在體內(nèi)通過S1PR1誘導巨噬細胞EPO/EPOR信號通路的表達以及活化。生理條件下阻斷S1PR1或阻斷細胞凋亡后小鼠脾臟EPO水平和脾臟巨噬細胞EPOR的表達均顯著降低。以上結果表明凋亡細胞釋放的S1P通過S1PR1誘導巨噬細胞EPO/EPOR通路的表達和活化。
　　第二部分我們研究了EPO/EPOR通路對巨噬細胞吞噬凋亡細胞的調(diào)控作用。體外研究結果表明，EPOR敲除后小鼠巨噬細胞對凋亡細胞

13、的吞噬顯著降低，而外源性rhEPO促進巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬。體內(nèi)注射凋亡細胞后檢測發(fā)現(xiàn)巨噬細胞條件性EPOR敲除小鼠腹腔巨噬細胞和脾臟巨噬細胞對凋亡細胞的體內(nèi)吞噬顯著降低，而外源性rhEPO促進WT小鼠腹腔巨噬細胞和脾臟巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬。生理條件下EPOR-cKO小鼠脾臟巨噬細胞吞噬凋亡細胞的比例顯著低于野生型小鼠。以上結果證明EPO/EPOR通路促進巨噬細胞吞噬凋亡細胞的調(diào)控作用。炎癥因子檢測發(fā)現(xiàn)rhEPO抑制巨噬細胞TN

14、F-α，IL-6，MCP-1的分泌，促進TGF-β分泌，而EPOR-KO腹腔巨噬細胞吞噬凋亡細胞后分泌較多TNF-α，IL-6，MCP-1和較少的TGF-β。我們在55周齡的老年EPOR敲除小鼠脾臟、外周血、胸腺、腎臟等組織中觀察到凋亡細胞的積累顯著增加，進一步表明EPOR-cKO小鼠中巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬清除能力是下降的。
　　第三部分研究結果顯示rhEPO能夠顯著誘導巨噬細胞PPARγ的表達水平，EPOR-cKO小鼠腹腔巨

15、噬細胞PPARγ的表達顯著降低。rhEPO不能促進PPARγ-cKO小鼠巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬，而PPARγ激動劑能夠促進EPOR-cKO小鼠巨噬細胞巨噬凋亡細胞，表明rhEPO促進巨噬細胞吞噬凋亡細胞通過PPARγ途徑。此外研究發(fā)現(xiàn)rhEPO能夠誘導野生型小鼠巨噬細胞而非PPARγ缺陷巨噬細胞Mfge8，Mertk，CD36和Gas6等與吞噬凋亡細胞相關的基因表達，進一步表明EPO通過上調(diào)PPARγ促進巨噬細胞吞噬凋亡細胞。

16、　　第四部分研究結果表明凋亡細胞培養(yǎng)基中的S1P能夠誘導巨噬細胞PPARγ表達顯著增加，S1P和凋亡細胞培養(yǎng)基能夠誘導野生型小鼠巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬，而不能促進EPOR-cKO和PPARγ-cKO小鼠巨噬細胞吞噬凋亡細胞。S1P能誘導野生型小鼠腹腔巨噬細胞Mfge8，Mertk，CD36和Gas6的表達，而不能誘導EPOR-cKO小鼠巨噬細胞上述分子表達的增加，進一步表明S1P通過EPO/EPOR促進巨噬細胞吞噬凋亡細胞。
　

17、　第五部分我們研究EPOR-cKO小鼠年齡依賴的SLE樣自身免疫性改變。研究發(fā)現(xiàn)40和55周齡EPOR-cKO小鼠血清抗雙鏈DNA，抗核抗體，抗Sm抗體顯著高于對照。55周齡EPOR-cKO小鼠腎臟沉積大量的IgG、IgA和C3，同時出現(xiàn)蛋白尿等腎功能受損的特征。此外在55周齡的EPOR-cKO小鼠皮膚中出現(xiàn)明顯的IgG沉積，肺部B細胞和巨噬細胞浸潤顯著，外周血促炎因子IL-6、MCP-1、TNF-α、IFN-α和IFN-β與野生型小鼠

18、相比顯著增加，而炎癥抑制因子TGF-β表達顯著降低。以上結果表明EPOR-cKO小鼠出現(xiàn)年齡依賴的SLE樣自身免疫性疾病。
　　綜上所述，我們的研究表明凋亡細胞釋放的S1P通過S1PR1誘導巨噬細胞HIF-1α表達，HIF-1α進一步誘導EPO/EPOR通路的表達與活化。EPO/EPOR通過誘導巨噬細胞PPARγ表達從而促進巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬。在EPOR-cKO小鼠中，EPOR敲除的巨噬細胞吞噬凋亡細胞能力降低，小鼠出現(xiàn)年齡