二氯甲烷肝臟毒性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【研究目的】
　　通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討二氯甲烷的肝臟毒性作用；探討Nrf2/ARE信號(hào)通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在二氯甲烷肝毒性中的作用機(jī)制，為二氯甲烷接觸人群的健康影響提供基礎(chǔ)資料，也為研究二氯甲烷中毒的臨床治療方法提供新的理論基礎(chǔ)。
　　【研究方法】
　　1、二氯甲烷肝臟毒性作用研究
　　選用SPF級(jí)健康雄性昆明小鼠（20-25g）48只，適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分成對(duì)照組、低劑量組（1.3mg/L，1/50LC50）、中劑

2、量組（6.4 mg/L，1/10LC50）和高劑量組（12.9 mg/L，1/5LC50）。對(duì)照組不染毒，正常喂養(yǎng)28d。染毒組采用呼吸道動(dòng)式染毒方式染毒，每天染毒1次，每次持續(xù)2h，連續(xù)染毒28d。各組小鼠在同等條件下飼養(yǎng)，觀(guān)察其一般生長(zhǎng)狀況，并在染毒第l、7、14、28d測(cè)小鼠體重。于染毒結(jié)束24h后處死小鼠，每組取6只小鼠的血清測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）活性。另6只則取肝臟測(cè)其濕重，取部分

3、肝組織HE染色后觀(guān)察組織病理學(xué)改變。取血清和肝組織勻漿測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽（GSH）含量和總抗氧化能力（T-AOC）。酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)肝組織勻漿中活性氧（ROS）、細(xì)胞色素P4502El（CYP2E1）含量。
　　2、Nrf2/ARE信號(hào)通路在二氯甲烷致小鼠肝臟毒性中的作用機(jī)制研究
　　選用SPF級(jí)健康昆明小鼠（20-25g）24只，適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、二

4、氯甲烷染毒組和叔丁基對(duì)苯二酚（tBHQ）干預(yù)組?？瞻讓?duì)照組不染毒，正常喂養(yǎng)28d。其余三組采用呼吸道動(dòng)式染毒方式高劑量（12.9 mg/L）染毒，每天1次，每次持續(xù)2h。染毒24h后，溶劑對(duì)照組每天經(jīng)口灌胃0.2ml玉米油，tBHQ干預(yù)組每天經(jīng)口灌胃0.2ml tBHQ質(zhì)量濃度為1.25mg/ml的玉米油，每周灌胃6d，連續(xù)28d。各組小鼠在同等條件下飼養(yǎng)，觀(guān)察小鼠的一般生長(zhǎng)狀況。于染毒結(jié)束后24h處死小鼠，取血清測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT

5、）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）活性。免疫組化法測(cè)Nrf2蛋白在肝組織的表達(dá)情況。酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)肝組織勻漿中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和血紅素氧化酶1（HO-1）含量。
　　【研究結(jié)果】
　　1、二氯甲烷對(duì)小鼠肝臟的毒性作用
　　染毒組小鼠每次染毒開(kāi)始時(shí)活動(dòng)異常，多動(dòng)、不安，一段時(shí)間后小鼠活動(dòng)減少，精神變得萎靡不振，聚團(tuán)靜伏。在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)，與對(duì)照組比較，染毒組小鼠

6、體重?zé)o明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，各劑量組肝臟濕重和臟器系數(shù)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　小鼠肝臟病理變化結(jié)果：對(duì)照組肝小葉清晰，肝索呈放射狀排列，肝細(xì)胞和肝竇正常；染毒組肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝索紊亂，肝竇充血，肝細(xì)胞彌漫水腫，出現(xiàn)空泡樣改變。高劑量組可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死伴炎細(xì)胞侵潤(rùn)。
　　小鼠肝功能指標(biāo)變化結(jié)果：與對(duì)照組比較，高劑量染毒組中AST、ALT和ALP酶活性升高明顯且差異均有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AST、ALT和ALP活性隨著染毒劑量的增加呈逐漸上升趨勢(shì)（r=0.829，r=0.932，r=0.589，P＜0.01）。
　　2、氧化應(yīng)激與二氯甲烷肝毒性的關(guān)系
　　與對(duì)照組比較，肝組織勻漿中各染毒劑量組 ROS含量升高明顯；中、高劑量組CYP2E1含量升高明顯（P＜0.05），且隨著染毒劑量的增加均呈逐漸上升趨勢(shì)（r=0.935， r=0.869，P＜0.01），兩者含量呈高度正相關(guān)（r=0

8、.858，P＜0.01）。
　　與對(duì)照組比較，血清和肝組織勻漿中SOD活性升高，MDA含量升高（P＜0.05），隨著染毒劑量的升高呈逐漸升高趨勢(shì)；血清中 GSH含量降低（P＜0.05），隨著染毒劑量的增加大體呈下降趨勢(shì)（r=-0.806，P＜0.01），肝組織勻漿中高劑量組 GSH含量升高明顯（P＜0.05），隨染毒劑量的增加呈上升趨勢(shì)（r=0.772，P＜0.01）；血清中、高劑量組T-AOC含量降低（P＜0.05），隨著染毒劑

9、量的增加血清T-AOC含量呈明顯下降趨勢(shì)（r=-0.692，P＜0.01），肝組織勻漿中T-AOC含量無(wú)明顯變化（P＞0.05）。
　　經(jīng)相關(guān)性分析，血清中和肝組織勻漿中MDA含量呈正相關(guān)（r=0.582，P＜0.05）， SOD活性呈正相關(guān)（r=0.608，P＜0.05），GSH含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.611，P＜0.05）， T-AOC含量不存在相關(guān)性（r=0.02，P＞0.05）。小鼠肝組織勻漿中ROS含量與血清中AST、A

10、LT、ALP酶活性均呈正相關(guān)（r=0.808，r=0.832，r=0.549，P＜0.01）。
　　3、Nrf2/ARE信號(hào)通路在二氯甲烷致小鼠肝臟毒性中的作用機(jī)制
　　對(duì)照組 Nrf2在少數(shù)肝細(xì)胞胞漿中表達(dá)，胞核內(nèi)未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)；溶劑對(duì)照組和二氯甲烷染毒組棕色顆粒在胞漿中表達(dá)增加，也有少量在細(xì)胞核表達(dá)；tBHQ干預(yù)組棕色顆粒在胞漿中的表達(dá)降低，主要集中于細(xì)胞核。
　　與空白對(duì)照組比較，溶劑對(duì)照組和二氯甲烷染毒組ROS、

11、MDA、GST和HO-1含量升高（P＜0.05），tBHQ干預(yù)組ROS、MDA含量變化不明顯，tBHQ干預(yù)組GST、HO-1含量升高（P＜0.05）；與溶劑對(duì)照組和二氯甲烷染毒組比較，tBHQ干預(yù)組ROS、MDA含量下降明顯，GST、HO-1含量升高明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　與空白對(duì)照組比較，溶劑對(duì)照組和二氯甲烷染毒組AST、ALT和ALP活性升高（P＜0.05），tBHQ干預(yù)組各指標(biāo)活性無(wú)明顯變化（P＞0.

12、05）；與二氯甲烷染毒組比較， tBHQ干預(yù)組各指標(biāo)活性下降明顯（P＜0.05）；與溶劑對(duì)照組比較，二氯甲烷染毒組AST、ALT活性升高，tBHQ干預(yù)組ALT活性降低（P＜0.05）。
　　【研究結(jié)論】
　　1、在本實(shí)驗(yàn)條件下二氯甲烷染毒后小鼠肝臟病理和肝功指標(biāo)發(fā)生變化，提示肝細(xì)胞受損，出現(xiàn)炎癥、壞死等。二氯甲烷可引起小鼠肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷。
　　2、氧化應(yīng)激在二氯甲烷誘導(dǎo)小鼠肝臟毒性中起重要作用。機(jī)體氧化應(yīng)激和脂質(zhì)

13、過(guò)氧化反應(yīng)的提高，抗氧化應(yīng)激能力的降低是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞損傷的重要原因。而氧化應(yīng)激的產(chǎn)生可能與二氯甲烷進(jìn)入肝臟后刺激CYP2E1合成增加有關(guān)。
　　3、二氯甲烷進(jìn)入小鼠體內(nèi)導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平的升高，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路的抗氧化能力，由于ROS升高的水平超出Nrf2/ARE信號(hào)通路的抗氧化能力，導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)耗竭，ROS清除不足在體內(nèi)蓄積進(jìn)而對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷。tBHQ作為抗氧化劑和通路激活劑，可增強(qiáng)Nrf2/ARE