基于全外顯子組測序的孤獨譜系障礙核心家系基因篩查研究及氟西汀早期處理斑馬魚的行為學(xué)改變.pdf

1、第一部分童年瓦解性精神障礙合并粘多糖癥ⅢA的同胞家系遺傳學(xué)研究
　　目的:
　　童年瓦解性精神障礙（Childhood disintegrative disorder，CDD）作為孤獨譜系障礙中的特殊亞型，是罕見的早發(fā)神經(jīng)退行性疾病。但臨床報道甚少且致病機(jī)制不清。本研究以一對患CDD的同胞兄弟為對象，利用現(xiàn)有的研究方法探索其可能的致病因素。
　　方法:
　　首先，利用全外顯子組測序（whole exome seq

2、uending,WES）對包括兩位患兒和健康父母在內(nèi)的家系進(jìn)行篩查分析；其次再結(jié)合臨床量表評估其癥狀表現(xiàn)，包括孤獨癥診斷訪談問卷（修正版）（ADI-R）、孤獨癥行為量表（ABC）和兒童孤獨癥評定量表（CARS）；再對所有家庭成員進(jìn)行核磁共振腦影像檢測（MRI），MRI掃描序列程序包括T1、T2和DTI；最后，行相關(guān)的生化檢查包括尿粘多糖檢測（uGAG）及溶酶體酶活力檢測。
　　結(jié)果:
　　據(jù)WES數(shù)據(jù)分析，兩位先證者的SGS

3、H基因均出現(xiàn)純合突變：p.F101S（c.302T>C），父母均攜帶同樣位點的雜合突變，符合常染色體隱性遺傳病模式。MRI檢查發(fā)現(xiàn)患兒皮質(zhì)普遍且嚴(yán)重萎縮，溝回加深，腦室擴(kuò)張；白質(zhì)纖維變性，尤其胼胝體膝部、壓部變薄。ADI-R得分表明社交互動和語言交流方面都遠(yuǎn)超臨界值，刻板行為相對較輕；CARS結(jié)果提示達(dá)到重度孤獨癥的程度；ABC得分也遠(yuǎn)高于孤獨癥篩查診斷界限分，且在兩年后隨訪分?jǐn)?shù)明顯增加。酶學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)患兒乙酰肝素-N-硫酸酯酶活性下降,

4、尿粘多糖定性陽性。
　　結(jié)論:
　　本研究明確了該對患兒致病位點 SGSH p.F101S。SGSH的突變直接導(dǎo)致該所編碼的乙酰肝素-N-硫酸酯酶的功能缺陷，引起粘多糖病III型A（MPS IIIA）。因此患者出現(xiàn)的癥狀可能與粘多糖累積有關(guān)。本研究也為CDD的病因提供了一種可能的解釋，進(jìn)一步給臨床醫(yī)生以鑒別診斷的線索。
　　第二部分利用全外顯子組測序在120例孤獨譜系障礙的家系中篩查MeCP2突變
　　目的:

5、r>　　甲基化 CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)能通過表觀遺傳作用調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育的重要蛋白，它的功能缺失或獲得性突變都會導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育性疾病，如瑞特綜合癥（Rett syndrome，RTT）和孤獨譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD）。本研究對 ASD患者展開了廣泛篩查，以期檢測 MECP2突變，并對突變行初步的功能探究。
　　方法:
　　對120位罹患ASD的兒童抽取外周血以提取基因組DNA

6、用于WES篩查，對其中篩出 MECP2突變的先證者及父母用Sanger測序驗證突變。用電轉(zhuǎn)法將MeCP2野生型、突變型的體外表達(dá)載體法轉(zhuǎn)入離體培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞及HEK-293細(xì)胞。蛋白印跡實驗驗證MeCP2的特異性表達(dá)并用免疫組化顯示并觀察神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)3個 MECP2基因突變：c.455C>T，p.P152L；c.1162C>T，p.P376S和c.880C>T，p.R294X。其

7、中p.P152L是未在患者中報道過的新突變，p.P152L和p.R294X為新發(fā)突變（de novo mutation），p.P376S突變遺傳自母親。MeCP2人源野生型及p.R294X截短突變過表達(dá)的主要對神經(jīng)元的樹突發(fā)育有抑制的作用，而突變型(p.P152L，p.P376S)表達(dá)的神經(jīng)元樹突及軸突的長度則無明顯改變。
　　結(jié)論:
　　通過對孤獨癥患者中篩出的MeCP2突變功能的初步探究，提示突變很可能影響到MeCP2調(diào)

8、節(jié)神經(jīng)元發(fā)育的相關(guān)功能，從而引起神經(jīng)元突起的長度的改變。本研究也提示MeCP2雖然在孤獨癥患者中突變頻率不高，但仍是需要檢測的重要候選基因。
　　第三部分氟西汀早期處理對斑馬魚幼魚急性期及遠(yuǎn)期行為的影響
　　目的:
　　SSRI類抗抑郁藥用于控制孤獨癥患兒的焦慮、抑郁等情緒癥狀及強(qiáng)迫行為，而氟西汀是其中最常使用的。通過研究早期暴露于氟西汀的斑馬魚，探索該藥物對斑馬魚主要神經(jīng)遞質(zhì)、自主運動、焦慮樣行為及遠(yuǎn)期社交功能的影響

9、。
　　方法:
　　用氟西汀早期慢性處理斑馬魚（受精后3到6天，3-6dpf），通過高效液相色譜法（HPLC）檢測斑馬魚腦部主要神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物水平；通過明暗交替實驗中斑馬魚的趨墻行為來判斷焦慮樣行為（7-9 dpf）；用社交偏好實驗評估斑馬魚社交行為的遠(yuǎn)期發(fā)展（30dpf）。
　　結(jié)果:
　　隨氟西汀劑量的增加，5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）水平不斷升高，而5-羥色胺（5-HT）、多巴胺(DA)及3,4-二羥

10、苯酰乙酸（DOPAC）在幼魚（7dpf）腦內(nèi)水平先增后減。在自主運動中，7dpf的氟西汀組游動距離顯著低于對照組（P<0.05）；在7dpf時氟西汀低劑量組（1.6μM、4μM）在連續(xù)光照情況下趨墻行為較對照組少（P<0.05）。在社交偏好實驗中，對照組在毗鄰魚群的區(qū)域內(nèi)總游動距離顯著高于氟西汀4μM和8μM組（P<0.01）；相應(yīng)游動時間的比較結(jié)果，也是對照組多于氟西汀4μM和8μM組（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　斑