利用全外顯子組深度測序技術(shù)篩選和驗證膀胱移行細胞癌中的突變基因.pdf

1、目的：利用全外顯子組深度測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)和篩選膀胱移行細胞癌(Transitional Cell Carcinoma Of Bladder，TCCB)中的致病候選突變基因，然后，應(yīng)用Sanger測序技術(shù)進行驗證，為膀胱癌病因?qū)W研究提供一定的理論依據(jù)，并探尋理想的腫瘤診斷標志物和有效的治療靶點。
　　方法：
　　第一部分，取蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2012年4月手術(shù)治療的4對膀胱移行細胞癌患者的癌及癌旁組織，其中2個病例為非肌層浸潤性

2、（非浸潤組），2個病例為肌層浸潤性（浸潤組）。采用SOLID深度基因測序的方法進行全外顯子組測序，并通過特定的篩選條件進行過濾，選出其中突變的候選致病基因。
　　第二部分，Sanger測序標本：一部分為蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供的2011年9月至2013年5月膀胱移行細胞癌手術(shù)切除標本50例，其中浸潤性26例，非浸潤性24例；另一部分來自江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院病理科提供的2010年3月至2012年12月膀胱移行細胞癌術(shù)后石蠟

3、包埋切片組織49例，其中浸潤性35例，非浸潤性14例；另取10例癌旁組織作為對照。應(yīng)用Sanger測序技術(shù)驗證深度測序中的突變結(jié)果。然后，采用免疫組化Envision二步法檢測制作的25例蠟塊，觀察HECW1（HECT，C2 and WW domain-containing protein1）蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達差異。
　　結(jié)果：
　　第一部分：深度測序結(jié)果數(shù)據(jù)質(zhì)量滿意，測序長度為75bp，準確度＞99％，平均覆蓋

4、度51×，捕獲效率62%，覆蓋度5×以上達92%。經(jīng)過篩選和過濾，發(fā)現(xiàn)眾多突變基因，非浸潤組候選基因有38個，浸潤組有40個，非浸潤組和浸潤組共有的候選基因有20個；而非浸潤組中插入和缺失（INDEL）有5個，浸潤組有3個，兩組共有的有1個。將在外顯子上檢測到的突變候選基因，經(jīng)過文獻檢索和復(fù)習(xí)，挑選出有功能介紹和與腫瘤相關(guān)的基因，分別是：IVL、RGPD5和ZNF79位于非浸潤組中；SRGAP2、FMN2、MUC6、CPNE7、MMP9

5、、MAGEE1和TRO位于浸潤組中；MUC4、HECW1和CTBP2是兩組共有的。其中，RGPD5可能參與了RAS-MAPK信號通路；CTBP2和HECW1可能在Wnt信號通路中起作用；而HECW1和MAGEE1均參加了泛素蛋白酶體信號途徑；MUC4能夠與ERBB2結(jié)合成復(fù)合體，在ERBB2信號通路中有著重要的作用；FMN2、CPNE7和MMP9在細胞周期調(diào)節(jié)和P53信號通路中對凋亡有著重要的影響。
　　第二部分：將在外顯子中檢測

6、到的13個經(jīng)過文獻檢索和復(fù)習(xí)的有功能的基因再次行SNP和標準核苷酸BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其中有6個非同義突變基因，分別是：IVL、RGPD5、CPNE7、ZNF97、HECW1和TCHH；5個同義突變基因，分別是：FMN2、MMP9、TRO、MAGEE1和MUC4。先選取非同義突變中4個基因（CPNE7、ZNF79、IVL、HECW1）應(yīng)用Sanger測序驗證，99例膀胱癌組織中僅有HECW1發(fā)現(xiàn)6例基因突變，比例為6.06%，均為點突變

7、，位于第11號外顯子，且與深度測序突變位點相同或在附近區(qū)域。其中，38例非浸潤性膀胱癌組織DNA中，1例同義突變，比例為2.63%；61例浸潤性膀胱癌組織DNA中，4例錯義突變和1例無義突變（即突變?yōu)榻K止密碼子），比例為8.20%，兩者突變比例無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），對照組10例未發(fā)現(xiàn)突變。不同醫(yī)院來源的標本中，鹽城市一院標本發(fā)生突變的比例（8.10%）明顯高于蘇大附一院（4%），兩者比較未發(fā)現(xiàn)有明顯差異（P>0.05）。免疫組化